作為細(xì)胞中的“回收站”，溶酶體在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，小優(yōu)曾經(jīng)為大家介紹過溶酶體降解（自噬）與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系，感興趣的小伙伴們請(qǐng)戳這兒了解。 

本文想帶大家將焦點(diǎn)從溶酶體降解轉(zhuǎn)移到溶酶體膜上，在溶酶體膜上也存在多種不同類型的蛋白質(zhì)，包括離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體、結(jié)構(gòu)蛋白、酶等, 其中離子通道蛋白由于他們?cè)谌苊阁w離子動(dòng)態(tài)平衡和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、溶酶體膜電位和pH以及細(xì)胞營養(yǎng)代謝水平的調(diào)控中的重要作用, 受到越來越多的關(guān)注。
 

圖1.溶酶體膜上的部分相關(guān)蛋白質(zhì)

早在2013年，賓夕法尼亞大學(xué)Dejian Ren課題組就在《Cell》上發(fā)表了對(duì)溶酶體膜表面離子通道TPCN1和TPCN2的相關(guān)研究，解釋了兩個(gè)通道如何通過感應(yīng)細(xì)胞外的饑餓環(huán)境（如氨基酸缺乏）來增強(qiáng)溶酶體功能，從而更好地利用溶酶體降解來回收生物大分子（如氨基酸），從而維持細(xì)胞的存活。除此之外，TMEM175、TRPM1、TRPM2、CLCN、CLCN35等都是溶酶體膜上的熱門離子通道/轉(zhuǎn)運(yùn)體靶標(biāo)。

近年來，TMEM175對(duì)帕金森綜合征（PD）的影響越來越受到研究者們的關(guān)注。2021年發(fā)表于《Nature》期刊，及今年6月發(fā)表于《Cell》期刊的兩篇文章均對(duì)這個(gè)與PD相關(guān)的溶酶體膜離子通道靶點(diǎn)進(jìn)行了研究，下面小優(yōu)就為大家來詳細(xì)剖析這兩篇文章。
 

圖2. TMEM175是溶酶體在生理酸性條件下氫離子激活通道，通過介導(dǎo)溶酶體氫離子外排來維持穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)pH的穩(wěn)定狀態(tài)

PART ONE: 生長因子通過調(diào)控溶酶體鉀離子通道參與帕金森病變

該文章揭示了TMEM175會(huì)與蛋白激酶protein kinase B (AKT) 形成一種神經(jīng)元溶酶體復(fù)合型鉀離子通道，通過感受胞外生長因子，將胞外信號(hào)分子與溶酶體的功能聯(lián)系起來，并且該通道的激活不依賴于激酶的催化活性。

作者首先驗(yàn)證了生長因子（胰島素、NGF、BDNF）可以激活饑餓狀態(tài)下小鼠原代海馬神經(jīng)元中的溶酶體鉀離子通道。如圖三所示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TMEM175且饑餓后，鉀離子電流就消失了（圖3），而通過喂養(yǎng)三種生長因子，消失了的鉀離子電流會(huì)重新出現(xiàn)。另外，如果在小鼠的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞中進(jìn)行TMEM175基因敲除，鉀離子電流也會(huì)相應(yīng)的消失。

圖3.溶酶體鉀離子通道可以被生長因子激活

該結(jié)果說明了TMEM175會(huì)參與通道孔的形成，介導(dǎo)溶酶體鉀離子通道。同時(shí)這個(gè)結(jié)果也暗示了生長因子或許可以間接性地通過其受體的靶點(diǎn)，如AKT，來激活TMEM175。因此，作者接下來又對(duì)AKT對(duì)TMEM175及對(duì)溶酶體鉀離子通道的激活及調(diào)控進(jìn)行了相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

如圖4和圖5，多個(gè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明AKT對(duì)溶酶體鉀離子通道的生成是必要的。且這些實(shí)驗(yàn)中的免疫沉淀結(jié)果也顯示了TMEM175和AKT之間有相互作用，這或許說明了兩者之前可以形成一種復(fù)合物，而這種復(fù)合物對(duì)于溶酶體鉀離子通道的形成是至關(guān)重要的。

 

圖4.AKT可以充分激活TMEM175

 

圖5.AKT可以通過與溶酶體鉀離子通道的相互作用機(jī)制激活TMEM175

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到這里已經(jīng)表明AKT對(duì)于TMEM175的激活是必要的，那么是否需要依賴AKT的激酶活性來對(duì)TMEM175進(jìn)行激活呢？答案是否定的，圖6就描繪了僅需要AKT構(gòu)象的改變，就可以使得TMEM175被激活，更多的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)請(qǐng)大家參考文獻(xiàn)。

 

圖6. AKT的構(gòu)象改變即可以對(duì)TMEM175通道進(jìn)行激活（GF=growth factors）

接著，作者又研究了TMEM175的兩種常見的次要等位基因（minor allele）rs34311866和rs34884217，分別對(duì)應(yīng)的是TMEM175通道的M393T和Q65P兩種突變。據(jù)研究，前者的變異與PD發(fā)病與進(jìn)展呈正相關(guān)，而后者則呈負(fù)相關(guān)。

如圖7（d）的電生理結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)（M393T突變），相較于野生型模型，突變型模型的電流有著顯著降低（基礎(chǔ)細(xì)胞降低43%和sc79激活細(xì)胞降低54%）。而對(duì)于Q65P突變，野生型樣本遭受饑餓3小時(shí)后電流消失，突變型樣本則在6小時(shí)后才會(huì)完全消失（圖6），說明突變后的模型對(duì)胞外生長因子的耐饑餓能力明顯更強(qiáng)。

這些結(jié)果表明兩種突變——M393T和Q65P——類型不同，前者是溶酶體鉀離子通道功能喪失型的突變而后者則是功能獲得型的突變。同時(shí)該文章的補(bǔ)充數(shù)據(jù)中也顯示了，相較于野生型，TMEM基因敲除后的神經(jīng)元對(duì)于神經(jīng)毒素（MPTP）等惡劣條件的抵御性明顯降低，而Q65P的突變模型則可以抵御這種損傷，進(jìn)一步說明了這類溶酶體鉀離子通道對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用。

 

圖7.常見的與帕金森病易感性相關(guān)的TMEM175突變（M393T和Q65P）對(duì)溶酶體鉀離子通道的雙向調(diào)節(jié)作用。

那么該研究中的這種溶酶體鉀離子通道如何與帕金森疾病相關(guān)呢？Alpha-Synuclein（α-突觸核蛋白，α-syn）積累是PD的標(biāo)志性病癥之一。如圖8所示，通過免疫熒光及組化實(shí)驗(yàn)，作者觀察到TMEM175敲除后的小鼠有明顯的α-syn累積，TMEM175部分降低的樣本（約降低50%）也會(huì)加速這種蛋白的聚集。這些結(jié)果表明TMEM175的缺失會(huì)損害小鼠多巴胺能神經(jīng)元和其運(yùn)動(dòng)能力。

 

圖8.溶酶體鉀離子通道的缺乏可導(dǎo)致小鼠致病性α-syn擴(kuò)散加速、多巴胺能神經(jīng)元喪失和運(yùn)動(dòng)功能受損。

該文章還進(jìn)行了臨床上的驗(yàn)證（圖9），結(jié)果顯示攜帶有M393T突變的帕金森病人明顯具有更低的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)能力（相較于無此突變的病人）。

 

圖9.M393T突變對(duì)帕金森病病程的臨床研究結(jié)果

PART TWO: 與帕金森疾病相關(guān)的TMEM175屬于溶酶體氫離子通道

 
今年6月份，該文章的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在生理酸性的條件下，通過TMEM175的離子主要為氫離子，而非鉀離子，并通過一系列的定量分析發(fā)現(xiàn)，TMEM175在該條件下對(duì)于氫離子的通透性是鉀離子的約5萬倍之多。

該作者對(duì)于這一研究的靈感來源于曾經(jīng)的一個(gè)發(fā)現(xiàn)：在對(duì)細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜直接進(jìn)行電生理記錄時(shí)，只要仿照生理?xiàng)l件，溶酶體膜內(nèi)外存在pH差別（膜外為pH=7.2的中性環(huán)境，膜內(nèi)為pH=4.6的酸性環(huán)境），就總是能夠記錄到從膜內(nèi)流向膜外的特異性微弱電流。假如將膜內(nèi)pH調(diào)整為更加酸性的3.5，這一信號(hào)會(huì)更加強(qiáng)烈。

基于此發(fā)現(xiàn)，作者做了如下的大膽假設(shè)：介導(dǎo)該電流的離子通道即是科學(xué)界正在尋找的溶酶體膜上的氫離子通道，與V-ATPase質(zhì)子泵互相配合，一進(jìn)一出，共同調(diào)節(jié)溶酶體的pH平衡。

因此，為了找出這一想要的氫離子通道，作者對(duì)一系列可能的溶酶體膜蛋白（除TMEM175外，還有TPC1/TRPML1/CLCN4/CLN8等）進(jìn)行了逐一的過表達(dá)測試（圖10）。發(fā)現(xiàn)只有在TMEM175過表達(dá)的時(shí)候，所記錄到的電流比其他膜蛋白高出20倍左右。同時(shí)，被基因敲除后的樣本，即使將pH設(shè)定在更低值（3.5）也沒有可觀察的電流。這些結(jié)論表明初步驗(yàn)證了TMEM175就是想要尋找的溶酶體氫離子通道。

 

圖10. TMEM175對(duì)于溶酶體質(zhì)子激活的質(zhì)子滲透電流是必要且充分的.

研究進(jìn)行到這里，發(fā)現(xiàn)了與之前研究相悖的結(jié)論，即前期研究普遍認(rèn)為TMEM175是一個(gè)鉀離子通道，接著該文章對(duì)兩者的差異又做了進(jìn)一步的研究。經(jīng)過仔細(xì)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，先前的文獻(xiàn)沒有針對(duì)pH對(duì)TMEM175功能的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行考慮，因此會(huì)認(rèn)為TMEM175主要通透的是鉀離子。

因此作者又進(jìn)行了一系列的將溶酶體內(nèi)部環(huán)境設(shè)置在跟接近生理?xiàng)l件pH環(huán)境的研究（如圖11），發(fā)現(xiàn)TMEM175在該pH條件下，具有更強(qiáng)的的氫離子通透性（大約是鉀離子的5萬倍）。
 

 

圖11.TMEM175通道具有很強(qiáng)的質(zhì)子通過性

除此之外，該研究還鑒定出小分子化合物DCPIB和ML 67-33也可以激活TMEM175通道。這些化合物不僅能在酸性條件下激活通道的氫離子電流，在中性條件下也同樣可以激活鉀離子電流（圖11）。除此之外,研究還發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)分子花生四烯酸（Arachidonic Acid, ArA）是TMEM175通道的內(nèi)源激活劑，說明脂質(zhì)信號(hào)通路也很可能對(duì)TMEM175的活性存在調(diào)節(jié)作用。

 

圖12.花生四烯酸（ArA）和合成化學(xué)物質(zhì)可以激活TMEM175

在細(xì)胞水平上，研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行TMEM175基因敲除后的細(xì)胞內(nèi)溶酶體的pH穩(wěn)態(tài)被破壞，此時(shí)的溶酶體處于一種酸性過強(qiáng)的狀態(tài)，并通過免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)部的蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin D的活性也因此受到影響（圖13）。
 

圖13. 通過TMEM175的質(zhì)子滲透是溶酶體pH平衡和有效的蛋白水解降解所必需的

接著研究者從細(xì)胞層面衍生至小鼠生物體內(nèi)，構(gòu)建了TMEM175基因敲除的動(dòng)物模型，如圖14所示，在小鼠神經(jīng)元組織中也同樣觀察到了溶酶體酸性過強(qiáng)、溶酶體降解功能受損的現(xiàn)象。同時(shí)，與神經(jīng)退行性疾病帕金森癥致病相關(guān)的α-Synuclein（前文提到）聚積現(xiàn)象在TMEM175基因敲除小鼠中也更為顯著，從而推測會(huì)對(duì)PD的病癥造成進(jìn)一步的影響。
 

圖14. 小鼠神經(jīng)元TMEM175的缺乏會(huì)導(dǎo)致溶酶體過度酸化，溶酶體水解活性受損，以及小鼠大腦中的α-Synuclein核蛋白的聚積

兩篇文章都為PD的研究提供了更廣闊的思路，特別是第二篇，揭示了TMEM175是一種新型的氫離子激活的氫離子通道。近年來，研究者在帕金森綜合征的病人體內(nèi)普遍檢測到了TMEM175基因的突變，未來，小優(yōu)預(yù)測會(huì)有更多的圍繞TMEM175調(diào)節(jié)機(jī)制，以及TMEM175如何影響神經(jīng)退行性模型的精彩研究被陸續(xù)發(fā)表。

同時(shí)，不少研究團(tuán)隊(duì)也正在研發(fā)用于調(diào)控溶酶體離子通道包括TRPML1和TMEM175在內(nèi)的靶向藥物，將來可能用于預(yù)防和治療與溶酶體代謝降解相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，如帕金森癥、阿爾茨海默病等。