蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）的6個(gè)基礎(chǔ)步驟：
1.樣品制備
2.通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì) 
3.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移（電印跡）到膜上 
4.膜封閉 
5.免疫檢測(cè)
6.靶蛋白顯印

WB法可用于檢測(cè)天然和合成來(lái)源的蛋白質(zhì)。來(lái)自表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白和來(lái)自生物樣品的內(nèi)源蛋白都可以用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

對(duì)于要通過(guò)WB分析的蛋白質(zhì)，首先必須要處理含有目標(biāo)蛋白的樣品，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)可用于分析。例如，在篩選表達(dá)時(shí)，通過(guò)裂解細(xì)胞來(lái)釋放蛋白質(zhì)，使其進(jìn)入分離基質(zhì)。

蛋白質(zhì)提取之后可以進(jìn)行變性和還原，目的是將蛋白質(zhì)分解成一級(jí)結(jié)構(gòu)，因此蛋白質(zhì)在電泳期間可以根據(jù)不同的分子量分離。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺變性凝膠電泳 (SDS-PAGE) 使用Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide（SDS）包裹蛋白質(zhì)，掩蓋蛋白質(zhì)固有的電荷并賦予它們大小成正比的整體均勻電荷。

接著要使用凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，將樣品加載到凝膠中，并施加電壓，蛋白質(zhì)向正極遷移。凝膠的密度阻礙了它們的遷移，使它們能夠按大小分開(kāi)。分離后，通過(guò)將凝膠和膜直接接觸并施加電場(chǎng)將蛋白質(zhì)拉入基質(zhì)中的原理，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移（electroblotted，電印跡）到膜上。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移之后是膜封閉步驟，該步驟使用蛋白質(zhì)溶液來(lái)最大限度地減少非特異性相互作用。然后將膜與特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗一起孵育。在進(jìn)一步的封閉步驟之后，偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合，從而使靶蛋白可視化。

比色或化學(xué)發(fā)光底物都可用于顯示來(lái)自報(bào)告酶偶聯(lián)物的信號(hào)。使用成像設(shè)備檢測(cè)來(lái)自熒光染料偶聯(lián)物的信號(hào)，并可用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)。

WB是一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室程序，可以檢測(cè)和分析許多蛋白質(zhì)及其相互作用。WB的成功取決于抗體抗原相互作用的特異性以及二抗的信號(hào)放大潛力。這些因素使蛋白質(zhì)印跡極其敏感，能夠檢測(cè)低至匹克（picogram）水平的蛋白質(zhì)。根據(jù)試劑類型和檢測(cè)方法，可以得到半定量和定量的檢測(cè)結(jié)果。

WB法可以高效可靠地進(jìn)行，以產(chǎn)生高質(zhì)量的印跡。本指南將幫助您選擇正確的試劑、合適的抗體和檢測(cè)方法，并協(xié)助您排除一些常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)故障。

一、樣品制備
在電泳過(guò)程中準(zhǔn)確分離蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)印跡的關(guān)鍵步驟。它依賴于樣品的正確處理，以便目標(biāo)蛋白質(zhì)成為可以通過(guò)凝膠進(jìn)行遷移的形式。

各種樣本來(lái)源的蛋白質(zhì)均可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析法來(lái)分析，如哺乳動(dòng)物、細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，或來(lái)自臨床組織樣品，每種樣品都需要不同的處理來(lái)產(chǎn)生最終用途的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。不同蛋白質(zhì)的提取方法詳見(jiàn)下表；然而，對(duì)于WB法，通�？赡懿⒉恍枰�如此嚴(yán)格地處理方法。

 

裂解方法	方法描述	適用應(yīng)用
凍融	使用液氮反復(fù)快速冷凍和解凍。冰晶的形成會(huì)破壞細(xì)胞膜并釋放 蛋白質(zhì)。	哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
滲透法	在高滲透和低滲透環(huán)境之間反復(fù)轉(zhuǎn)移以破壞細(xì)胞膜并釋放蛋白質(zhì)。	哺乳動(dòng)物和細(xì)菌周質(zhì)組分分解
超聲波處理	使用高頻聲波破壞細(xì)胞膜。比較簡(jiǎn)單，成本低。然而，超聲波處理也會(huì)產(chǎn)生熱量，必須通過(guò)在超聲波處理之間將樣品在冰上冷卻來(lái)控制熱量。	大腸桿菌、哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物
酶消化	溶菌酶分解堅(jiān)硬、富含碳水化合物的細(xì)胞壁。	細(xì)菌、酵母和植物培養(yǎng)物
均質(zhì)化（機(jī)械）	在冷凍緩沖液中機(jī)械切碎樣品，通常使用Waring或Polytron攪拌器，通過(guò)液體剪切力破壞細(xì)胞膜。還可能包括各種尺寸的玻璃珠以促進(jìn)剪切。機(jī)械研磨（例如研缽和研杵），有時(shí)在超低溫（液氮）下進(jìn)行。	哺乳動(dòng)物和植物組織 細(xì)菌和酵母細(xì)胞培養(yǎng)物
減壓	在將樣品轉(zhuǎn)移到低壓室之前，在高壓  (~5500  kPa) 下平衡細(xì)胞�？焖俚膲航凳辜�(xì)胞破裂。高壓可以在壓力機(jī)中或用惰性氣體（例如氮?dú)猓┮詸C(jī)械方式產(chǎn)生。	細(xì)菌培養(yǎng)
洗滌劑	將細(xì)胞樣品離心，然后重懸于含有洗滌劑的裂解緩沖液中。這種洗滌劑會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解并釋放蛋白質(zhì)。	哺乳動(dòng)物、昆蟲和細(xì)菌培養(yǎng)物

由于免疫印跡的特異性，可以對(duì)用于蛋白質(zhì)印跡的樣品進(jìn)行粗略處理，以便提取蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到適合將樣品引入分離凝膠進(jìn)行電泳的溶液中。由于存在諸如DNA之類的聚合生物分子，粗制樣品尤其可能是粘性的，并且可能會(huì)影響凝膠加載。

例一：針對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)樣品的制備工藝
1.取1ml大腸桿菌培養(yǎng)物樣品并轉(zhuǎn)移到冰上的微量離心管中。
2.在4°C下以13,000rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)2分鐘。
3.棄去上清液。
4.在50µl上樣緩沖液中重懸細(xì)胞，并在100°C下煮沸5分鐘。
5.3,000rpm離心5分鐘。
6.上樣

例二：貼壁細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物(HEK293)的示例樣品制備。 
1.將組織培養(yǎng)板置于冰上，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。
2.吸出PBS，然后加入適量的裂解緩沖液（例如1mL/107個(gè)細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿150cm²燒瓶；每5×106個(gè)細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿/75cm²燒瓶0.5mL）。
3.使用細(xì)胞刮刀從孔/燒瓶中分離細(xì)胞，然后用移液器吸頭或通過(guò)胰蛋白酶化。
4.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的微量離心管中。
5.然后在4°C下對(duì)樣品進(jìn)行微量離心。條件取決于細(xì)胞類型，應(yīng)根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)設(shè)置確定。例如，HEK293可以在1000rpm下耐受15分鐘。
6.從沉淀的細(xì)胞中吸出上清液并轉(zhuǎn)移到冰上的新試管中。
7.將負(fù)載染料加入上清液并在100°C下煮沸5分鐘。
8.細(xì)胞沉淀也可與上清液一起上樣染料。

將樣品以13,000 rpm的速度旋轉(zhuǎn)5分鐘，然后上樣到凝膠中進(jìn)行電泳。 

二、裂解和溶解
為了使蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入分離凝膠，必須將樣本進(jìn)行裂解，因此樣品制備的第一階段是裂解。通過(guò)裂解提取細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，裂解會(huì)破壞細(xì)胞的質(zhì)膜和/或細(xì)胞壁，以釋放蛋白質(zhì)。細(xì)胞外表達(dá)（分泌）的蛋白質(zhì)不需要裂解，盡管可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理以觀察由于合成不當(dāng)而捕獲的蛋白質(zhì)。

大規(guī)模蛋白質(zhì)純化——提取方法
可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)自各種來(lái)源的蛋白質(zhì)。樣品可能來(lái)自蛋白表達(dá)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，或來(lái)自臨床組織樣品，每種都需要不同的處理來(lái)產(chǎn)生可用的印跡。

用于蛋白質(zhì)提取的方法取決于樣品的性質(zhì)。蛋白質(zhì)表達(dá)在哺乳動(dòng)物、昆蟲、細(xì)菌和酵母等不同類型的細(xì)胞中進(jìn)行，一些樣本可能來(lái)自組織；這些樣本具有結(jié)構(gòu)特異性因此需要實(shí)施不同的處理方式。

分泌蛋白
哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的一些蛋白質(zhì)可能在上清液中表達(dá)，因此不需要從細(xì)胞中提取。 tip：保留上清液樣本，并在篩選表達(dá)時(shí)將其上樣至細(xì)胞裂解液旁邊的凝膠上。 

篩選和處理
蛋白質(zhì)表達(dá)通常通過(guò)western blotting進(jìn)行篩選。例如，幾個(gè)克隆的表達(dá)可以進(jìn)行相互比較，或者它們?cè)诓煌�表達(dá)系統(tǒng)中具有不同的表達(dá)。在這些篩選試驗(yàn)中，從蛋白質(zhì)樣本中取出樣品并上樣用于分析。通常會(huì)將上清液與細(xì)胞沉淀進(jìn)行比較，以定位表達(dá)發(fā)生的位置。 Coomassie染色所觀察到的總蛋白可以與在western blot中特異性檢測(cè)到的靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較。

篩選試驗(yàn)中進(jìn)行的基本處理可能不能代表最終表達(dá)是如何處理以供最終使用的，例如晶體學(xué)試驗(yàn)需要更精細(xì)的純化步驟。 

圖  1：在一系列細(xì)胞裂解物中檢測(cè) His 標(biāo)簽蛋白。以100 ng的濃度將C末端His-Tagged蛋白添加到細(xì)胞裂解物中。將HEK 293、CHO、BL21 E.Coli和Sf9昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞裂解物還原并在100°C下煮沸5分鐘，然后以9μg/孔的速度加載到串聯(lián)SDS凝膠中。A.蛋白質(zhì)印跡。將凝膠電印跡到硝酸纖維素膜上，用PBS/0.2%  Tween  20中的5% BSA封閉，并用Jackson  ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)探測(cè)以1:20K稀釋并使用數(shù)字成像儀進(jìn)行可視化。 B.凝膠用Coomassie染色。

三、裂解緩沖液
裂解緩沖液的目的是破壞細(xì)胞膜以釋放蛋白質(zhì)。裂解緩沖液通常包括破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層并形成膠束的去污劑。有許多緩沖液配方已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可用于不同的細(xì)胞類型或蛋白質(zhì)表達(dá)位置，例如裂解液RIPA或NP-40。材料的加工應(yīng)在冰上進(jìn)行，以盡量減少因細(xì)胞成分帶來(lái)的對(duì)蛋白質(zhì)降解和變性。

蛋白酶及其抑制 
溶解的方法，如涉及到對(duì)細(xì)胞的機(jī)械破壞過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的釋放。這些蛋白酶可以消化和截?cái)喔信d趣的蛋白質(zhì)，這可能會(huì)導(dǎo)致在膜上觀察到多個(gè)條帶。

蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性取決于它們的氨基酸組成，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)比細(xì)胞表面或細(xì)胞外蛋白質(zhì)的抵抗力低。膜蛋白被洗滌劑溶解時(shí)，特別容易被蛋白酶降解。生物信息學(xué)工具可以提前預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)水解的敏感性。蛋白酶抑制劑可用于防止蛋白質(zhì)水解;它們可以是化學(xué)抑制劑和酶抑制劑的混合物，可以加入裂解緩沖液中，然后再加入細(xì)胞或儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的緩沖液中。

有一系列的抑制劑可以對(duì)常見(jiàn)種類的絲氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸蛋白酶，以及米諾肽酶和金屬蛋白酶起效。不同的表達(dá)系統(tǒng)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)活性抑制的敏感性可能會(huì)阻止某些抑制劑的使用。通�？墒褂玫鞍酌敢种苿┑膶Ｓ谢旌衔铮�或單獨(dú)的試劑也可以應(yīng)用。

在緩沖液選擇上，疊氮也可以是蛋白酶的來(lái)源以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。去磷酸化可能發(fā)生在細(xì)胞被裂解之后。如果磷酸化的蛋白是western blotting的目標(biāo)蛋白，那么磷酸酶抑制劑，如釩酸鈉（sodium vanadate），也應(yīng)該添加到裂解緩沖液。樣品應(yīng)在整個(gè)樣品制備過(guò)程中冷藏，以盡量減少降解和去磷酸化的可能性。

下表列出了一些抑制劑和添加劑的例子：

抑制劑	蛋白酶	注意事項(xiàng)
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Metalloproteases	與一些親和層析柱不相容，可能抑制需要二價(jià)陽(yáng)離子的酶
Pepstatin	acid proteases–pepsin
Leupeptin	Serine and Cysteine proteases	有毒性的
TLCK (nα-tosyl-l-lysine chloromethyl ketone hydrochloride)	Serine proteases (Trypsin like proteases)	有毒/難聞的氣味
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), AEBSF 是一種常見(jiàn)的水溶性版本，具有更穩(wěn)定的性質(zhì)	Serine proteases	神經(jīng)毒素。保質(zhì)期短，隨用隨配。
Azide	Bacterial growth	會(huì)干擾下游加工/檢測(cè)。有毒性的。
Sodium orthovanadate	ATPase, alkaline phosphatase and tyrosine phosphatases	有毒性的
Sodium pyrophosphate	Serine/threonine phosphatases.	腐蝕性且刺激性

pH
裂解緩沖液的pH值對(duì)于樣品制備過(guò)程中的控制很重要，以確保穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的活性得以維持。通過(guò)使用正確pH值的緩沖液，可確保蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和溶解度，防止聚集和沉淀。與穩(wěn)定性相關(guān)的是蛋白質(zhì)的活性。使用正確的pH值可確保留蛋白質(zhì)以供下游使用。

緩沖液的pH值通常比蛋白質(zhì)等電點(diǎn)高或低一個(gè)pH單位，通常在pH6和8之間的生理范圍內(nèi)。使用含有弱酸與其共軛堿的組合，或弱堿與其共軛酸的組合。下表為大家列出了常見(jiàn)緩沖液及它們的pH范圍。

 

緩沖液	pH范圍
Citric acid – NaOH	2.2 – 6.5
Sodium citrate – citric acid	3.0 – 6.2
Sodium acetate – acetic acid	3.6 – 5.6
Cacodylic acid sodium salt – HCl	5.0 – 7.4
MES – NaOH (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)	5.6 – 6.8
Sodium dihydrogen phosphate – disodium hydrogen phosphate	5.8 – 8.0
Imidazole HCl	6.2 – 7.8
MOPS – KOH (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)	6.6 – 7.8
Triethanolamine hydrochloride – NaOH	6.8 – 8.8
Tris – HCl ( Tris(hydroxymethyl)aminomethane)	7.0 – 9.0
HEPES – NaOH(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )	7.2 – 8.2
Tricine – NaOH	7.6 – 8.6
Sodium tetraborate – boric acid	7.6 – 9.2
Bicine – NaOH	7.7 – 8.9
Glycine – NaOH	8.6 – 10.6

Tween試劑
非離子洗滌劑可用于增加非極性、不溶性蛋白質(zhì)的溶解度。例如Triton™X-100和Tween(r) - 20。

滲透壓穩(wěn)定劑 
當(dāng)從特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中純化蛋白質(zhì)時(shí)，例如來(lái)自真核細(xì)胞的細(xì)胞器、脂質(zhì)膜或來(lái)自細(xì)菌周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞裂解步驟中需要加入滲透穩(wěn)定劑，例如高濃度的蔗糖。它們的加入有助于在裂解過(guò)程中穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，還可以防止細(xì)胞壁降解過(guò)程中的細(xì)胞裂解。

在分離出的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特定重力下進(jìn)行離心，并加入密度梯度(如蔗糖或甘油分餾)，通常在western blotting前進(jìn)一步富集亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)。

滲透穩(wěn)定劑的存在可能會(huì)影響蛋白質(zhì)在凝膠上的遷移方式，并且樣品可能需要在上樣前稀釋到不同滲透強(qiáng)度的緩沖液中。

鹽類
添加鹽以改變緩沖溶液的離子強(qiáng)度。加鹽可提高蛋白質(zhì)溶解度；然而，過(guò)多的鹽會(huì)降低溶解度并使蛋白質(zhì)沉淀。

通過(guò)優(yōu)化溶液的離子強(qiáng)度，可以⿎勵(lì)蛋白質(zhì)保持其折疊構(gòu)象，從而通過(guò)防止易受攻擊的內(nèi)部殘基暴露來(lái)阻止蛋白水解造成的損害。表面電荷的穩(wěn)定會(huì)阻止蛋白質(zhì)聚集。 

樣品澄清
使用離心來(lái)澄清樣品。它可以在裂解后使用，從而將細(xì)胞裂解物以非常高的速度超速離心較長(zhǎng)時(shí)間以沉淀細(xì)胞碎片和染色體DNA，然后將其丟棄并保留含有溶解蛋白質(zhì)的溶液。

對(duì)于在細(xì)胞外表達(dá)到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，必須調(diào)整離心的速度和持續(xù)時(shí)間，以提供破壞性較小的條件以防止細(xì)胞裂解。離心，通常通過(guò)密度梯度，也用于分離細(xì)胞部分。例如，微粒體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜）可以在初始澄清后通過(guò)低速離心以高速沉淀。 

未正確澄清的裂解物和高NaCl濃度的細(xì)胞成分殘留物可能導(dǎo)致SDS-PAGE期間樣品中的蛋白質(zhì)分離不正確，從而導(dǎo)致條帶模糊或蛋獲得非目的分子量的蛋白。

核酸的存在也會(huì)堵塞孔并影響樣品遷移，因此可以添加脫氧核糖核酸酶(DNase)以消除這種污染物。也可以進(jìn)行透析或凝膠過(guò)濾以降低NaCl濃度。這些凈化技術(shù)能夠在電泳過(guò)程中實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的分離

樣品濃度
理想情況下，應(yīng)在上樣前使用Bradford、Lowry或二辛可寧酸(BCA)測(cè)定等方法來(lái)確定樣品的總蛋白質(zhì)濃度。預(yù)先確定的樣品濃度使分離凝膠中的孔能夠加載相同的體積和濃度，以優(yōu)化整個(gè)凝膠的一致性。如果將過(guò)多的蛋白質(zhì)裝入孔中，則會(huì)影響相鄰泳道中蛋白質(zhì)的遷移，從而難以解釋結(jié)果。

根據(jù)孔的大小，每條泳道10-50µg的總蛋白量就足夠了。但是，如果使用純蛋白質(zhì)，這個(gè)重量可能會(huì)過(guò)于濃縮。

低豐度蛋白可能需要濃縮，以便于western blot檢測(cè)。純化標(biāo)記(如HIS6標(biāo)記)允許使用親和柱(如鎳)濃縮蛋白質(zhì)。確保洗脫緩沖液與加載緩沖液兼容是很重要的。另外，如果有針對(duì)特定蛋白質(zhì)的抗體，可以使用免疫沉淀等方法有效地濃縮蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)濃縮
大型蛋白質(zhì)制備通常需要在純化步驟中進(jìn)行濃縮步驟，以將材料體積減少到更易于管理的尺寸。親和、離子交換和金屬色譜或切向流過(guò)濾可用于去除多余的液體體積并濃縮總蛋白或目標(biāo)蛋白。 WB樣品可能不需要濃縮步驟，因?yàn)橛捎诩夹g(shù)的敏感性，蛋白質(zhì)的豐度不太可能低于檢測(cè)限。 

最佳蛋白質(zhì)濃度
在孔中加載過(guò)多的蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)意外遷移，但設(shè)置不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)遷移，例如當(dāng)加載緩沖液中鹽或變性劑（如鹽酸胍）濃度過(guò)高時(shí)。此外，在凝膠或蛋白質(zhì)印跡運(yùn)行期間過(guò)度升高溫度的凝膠運(yùn)行條件（例如，運(yùn)行緩沖液中的電壓或鹽濃度過(guò)高）會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)分離產(chǎn)生負(fù)面影響。請(qǐng)參閱第4章，了解如何解決相關(guān)的技術(shù)問(wèn)題。

下表列出了一些常見(jiàn)的樣本準(zhǔn)備問(wèn)題

Effect	Cause	Solution
Gummy or viscous sample/ poor gel entry or migration	DNA	DNAse
Loading dye changing color	pH	Buffer exchange or addition of acid/base
Diffuse band	Low or high salt	Buffer exchange

四、上樣條件及緩沖液
在上樣之前，將樣品與上樣緩沖液混合，這有助于蛋白質(zhì)變性和將樣品上樣到分離凝膠中。它通常是染料、還原劑和變性劑以及甘油的組合。 

然后將樣品在100°C下煮沸5分鐘，然后在上樣前短暫離心。在某些情況下，對(duì)于高度疏水的整合膜蛋白，需要低于100°C的溫度。 

染色劑上樣
將加載染料添加到樣品中，以可視化電泳期間的加載和樣品遷移。一種常用的上樣緩沖液  Laemmli上樣緩沖液是溴酚藍(lán)、甘油、Tris、SDS和還原劑（如DTT或BME）的組合。由于體積小，溴酚藍(lán)比樣品中的蛋白質(zhì)遷移速度更快，并提供了一個(gè)遷移前沿來(lái)監(jiān)測(cè)電泳過(guò)程并防止樣品流失。如果遇到酸性條件，它也會(huì)變黃，表明緩沖系統(tǒng)不足，或省略了處理步驟。甘油使樣品比運(yùn)行緩沖液更稠密，使樣品能夠“下沉”到孔的底部。在加載緩沖液中煮沸樣品后，將樣品短暫離心。

 

五、氧化與還原條件
通過(guò)WB分析的樣品被變性和還原，以便蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中根據(jù)它們的分子量進(jìn)行分解。添加還原劑，如β-巰基乙醇(BME)或二硫蘇糖醇(DTT)，可減少半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。  SDS處理通過(guò)破壞殘基內(nèi)和殘基之間的非共價(jià)鍵使蛋白質(zhì)變性，從而將蛋白質(zhì)線性化為“松軟”的氨基酸鏈。SDS還有效地飽和蛋白質(zhì)的聚酰胺骨架，降低電荷對(duì)蛋白質(zhì)遷移的影響。 

六、注意事項(xiàng)
樣品的不完全還原可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)無(wú)法按預(yù)期解析，這可能會(huì)被觀察為拖尾條帶或不理想大小的條帶。因此，應(yīng)在使用當(dāng)天將新鮮的還原劑添加到加載緩沖液中。加熱不足也會(huì)導(dǎo)致樣品不完全變性。

七、天然或非還原凝膠
非還原或天然凝膠用于觀察蛋白質(zhì)的天然行為，例如它們的化學(xué)計(jì)量或與溶液中其他蛋白質(zhì)的相互作用。這些蛋白質(zhì)通常通過(guò)考馬斯或銀染色而不是免疫印跡來(lái)觀察。在這種情況下，不應(yīng)將還原劑添加到加載緩沖液中，從加載和運(yùn)行緩沖液中去除SDS，并且不要煮沸樣品。表5根據(jù)所需的蛋白質(zhì)狀態(tài)詳細(xì)說(shuō)明了緩沖液中的成分。溴酚藍(lán)通常也被添加到上樣緩沖液中，以使凝膠電泳過(guò)程中的蛋白質(zhì)遷移可視化。由于體積小，溴酚藍(lán)比樣品中的蛋白質(zhì)遷移速度更快。

下表比較了不同狀態(tài)蛋白質(zhì)和緩沖液組成：

Protein State	Sample Loading Buffer	Gel Running Buffer
Reduced and denatured	SDS βME or DTT Boil 5–10 minutes* *for integral membrane proteins, lower temperature (e.g. 70 degrees C) may be preferred	SDS
Reduced and native	βME or DTT	No SDS
Oxidized and denatured	SDS Boil 5–10 minutes	SDS
Oxidized and native		No SDS