逆轉(zhuǎn)錄是指以 RNA 為模板，合成與其互補的 cDNA 的過程。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 是將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）和 cDNA 的聚合酶鏈式反應（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，故逆轉(zhuǎn)錄稱為 RT-PCR 或反轉(zhuǎn)錄 PCR。

逆轉(zhuǎn)錄 PCR 實驗原理：
提取組織或細胞中的總 RNA，以 RNA 為模板，首先在利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再以 cDNA 鏈為模板進行 PCR 擴增，從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的出現(xiàn)使 RNA 檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能。

逆轉(zhuǎn)錄 PCR 應用

逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的用途廣泛，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、檢測細胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探針、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在臨床上 RT-PCR 可以用于遺傳病診斷、癌癥檢測、檢測病人標本中的 RNA 病毒，如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究環(huán)境脅迫對植物基因表達的影響，以及在特定的環(huán)境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用 RT-PCR 檢測分析 RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點：

1、 理論上可以檢測幾乎任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；

2、可以實現(xiàn)極為微量 RNA 樣品（ng 級別）的檢測；

3、樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測；

實驗流程：
從細胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs 的反應體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補 cDNA 鏈變性→常規(guī) PCR 反應流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。

模板

逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的模板是 RNA，可以是總 RNA、mRNA 或體外轉(zhuǎn)錄的 RNA 產(chǎn)物。無論使用何種 RNA，都需確保 RNA 中無 RNA 酶和基因組 DNA 的污染。

RNA 提取

可以利用試劑盒從細胞（或組織）中提取得到 RNA。模板 RNA 的純度和完整性對于擴增的結(jié)果有很大影響，從細胞中分離 RNA 應注意盡量減少 RNA 酶的污染（RNA 酶分布廣泛，除細胞內(nèi)源性 RNA 酶外環(huán)境中也存在大量 RNA 酶），在提取 RNA 時，應盡量創(chuàng)造一個無 RNA 酶的環(huán)境：避免 RNA 酶污染包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制內(nèi)源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通過 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和強力的蛋白質(zhì)變性劑抑制內(nèi)源性 RNA 酶。

引物

用于反轉(zhuǎn)錄的引物有隨機引物、通用引物（Oligo-dT）及基因特異性引物三種，下表為三種引物的介紹：

引物最好選擇 Oligo-dT 或基因特異性引物，隨機引物會從 RNA 的多個位點(包括核糖體 RNA)開始轉(zhuǎn)錄，特異性低。Oligo-dT 引物同大多數(shù)真核細胞 mRNA3'端的 poly(A)尾雜交，與使用隨機引物相比特異性高。但是 Oligo-dT 引物對 RNA 樣品的質(zhì)量要求較高，對于從福爾馬林固定的組織中提取的劣質(zhì) RNA 不適合用 Oligo-dT 引物。

逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于 RNA 病毒體內(nèi)的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實驗中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下三種活性

1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈；

2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 雜合體中的 RNA;

3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一條 DNA 鏈為模板合成互補的雙鏈 DNA

在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時，建議選擇無 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNaseH 活性會與聚合酶活性競爭 RNA 模板與 DNA 引物（或 cDNA 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的產(chǎn)量與長度。