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從多個(gè)影響因素入手,提高獲得常用載體工具質(zhì)粒質(zhì)量的方法

瀏覽次數(shù):2617 發(fā)布日期:2022-6-23  來源:濟(jì)凡生物公眾號(hào)
質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體工具,方便目的DNA片段的插入整合進(jìn)而獲得重組質(zhì)粒,然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞,最后利用質(zhì)粒上的功能元件,實(shí)現(xiàn)目的DNA片段的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及相應(yīng)蛋白的表達(dá)。

除了在科研領(lǐng)域的普遍應(yīng)用,重組質(zhì)粒已廣泛應(yīng)用在多類生物醫(yī)藥產(chǎn)品研發(fā)生產(chǎn)中,例如重組蛋白藥物、質(zhì)粒DNA疫苗、基因治療藥物以及CAR-T藥物等。目前,質(zhì)粒已是基因工程實(shí)施過程中的一個(gè)基礎(chǔ)工具。

高品質(zhì)質(zhì)粒的獲得是下游各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成功的重要保障。質(zhì)粒提取主要包括三個(gè)基本步驟:質(zhì)粒DNA在菌體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)繁、質(zhì)粒DNA從菌體細(xì)胞中的裂解釋放和裂解液中游離質(zhì)粒DNA的分離與純化。堿裂解法是最常用的質(zhì)粒DNA提取方法,根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性基因組DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的變性-復(fù)性速率不同進(jìn)行分離,具有得率高,適用廣,提取快速等特點(diǎn)。

質(zhì)粒提取之后,可以使用多種方法評(píng)價(jià)提取的質(zhì)量。一般評(píng)價(jià)質(zhì)粒提取效果的指標(biāo)包括得率、純度和超螺旋質(zhì)粒比例和內(nèi)毒素含量。紫外分光光度法一般用于測(cè)定質(zhì)粒得率和純度,當(dāng)測(cè)值OD260/280=1.7-1.9、OD260/230>2時(shí)表示質(zhì)粒純度較好;同時(shí),結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法觀察質(zhì)粒樣品在凝膠中帶型、大小和亮度,可以判斷濃度、超螺旋質(zhì)粒比例和純度(主要是基因組DNA、RNA和蛋白等殘留)。質(zhì)粒樣本在瓊脂糖凝膠中的最理想狀態(tài)是呈現(xiàn)單一的超螺旋條帶,但多數(shù)情況是會(huì)呈現(xiàn)2條或3條帶。這是由質(zhì)粒的不同構(gòu)型在凝膠電泳中的泳動(dòng)速率不同造成的,超螺旋質(zhì)粒跑的最快,其條帶越亮表明質(zhì)粒完整性越好。在對(duì)質(zhì)粒DNA純度要求高的應(yīng)用場(chǎng)景中,內(nèi)毒素水平也是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。內(nèi)毒素含量測(cè)定通常采用金標(biāo)準(zhǔn)的鱟試劑法定量檢測(cè),當(dāng)內(nèi)毒素含量低于0.1EU / µg 時(shí),通常被認(rèn)為是無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

那么,如何提取到高質(zhì)量的質(zhì)粒、提高下游實(shí)驗(yàn)的成功率呢?經(jīng)驗(yàn)表明,質(zhì)粒質(zhì)量受多種因素影響,除了試劑盒本身性能外,也與宿主菌株,培養(yǎng)基類型,培養(yǎng)條件,質(zhì)粒類型,質(zhì)粒大小和拷貝數(shù)等有關(guān)。

 
 菌株類型 
用于提取質(zhì)粒的宿主菌大多數(shù)是大腸桿菌,而菌株類型往往會(huì)對(duì)質(zhì)粒 DNA的提取質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。DH5α 和XL1-Blue是較為常用的宿主菌株,轉(zhuǎn)化效率較高,質(zhì)粒產(chǎn)量較大,通?梢詽M足高質(zhì)量質(zhì)粒 DNA的制備。其他菌株如 HB101,裂解時(shí)則會(huì)釋放大量的糖類代謝物,如果殘留較多,會(huì)抑制后續(xù)的酶促反應(yīng),進(jìn)而對(duì)提取的質(zhì)粒 DNA質(zhì)量帶來不利影響。此外,含有較高內(nèi)切酶活性的宿主菌株,會(huì)降低質(zhì)粒DNA得率。因此,宿主菌株的類型需要根據(jù)具體用途來做出選擇。
 
 質(zhì)粒類型 
質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù)均一定程度影響質(zhì)粒得率。通常來講,質(zhì)粒越大或插入的DNA片段越大,質(zhì)粒DNA產(chǎn)量越低。細(xì)菌中質(zhì)粒的拷貝數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。對(duì)于低拷貝質(zhì)粒,菌液量往往需要更多才能獲得較高的質(zhì)粒濃度。而且,部分細(xì)菌菌株內(nèi),可以選擇在培養(yǎng)階段加入氯霉素,以提高宿主細(xì)胞的質(zhì)粒產(chǎn)量。
 
 菌液投入量 
由于菌體生長的營養(yǎng)類型,生長條件(振蕩速度、溫度、時(shí)間),宿主菌株或質(zhì)粒插入類型等的影響,細(xì)菌培養(yǎng)的最終細(xì)胞濃度變化范圍極大。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值,OD600為1的1升大腸桿菌培養(yǎng)液包含1×1012個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞濕重約為1.5-1.8g。由于菌液體積不能反映出細(xì)菌細(xì)胞濃度與重量,而細(xì)胞重量的測(cè)定具有一定局限性,所以采用兩個(gè)便于測(cè)量的變量值的乘積作為提取質(zhì)粒前確定菌量的標(biāo)準(zhǔn)(ODV=菌液吸光值OD600×菌液體積V)。以濟(jì)凡質(zhì)粒大提試劑盒為例,測(cè)試菌液樣本的ODV值與質(zhì)粒得率的相關(guān)性,結(jié)果表明,質(zhì)粒DNA得率與投入菌量顯著相關(guān)。菌體投入量過多易導(dǎo)致菌體裂解不充分,質(zhì)粒得率下降。因此,選擇適當(dāng)?shù)木毫渴翘岣哔|(zhì)粒得率的關(guān)鍵因素。
 
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 菌體培養(yǎng)條件 
對(duì)于含常規(guī)的高拷貝質(zhì)粒宿主菌的培養(yǎng),推薦使用 LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基。為了使細(xì)菌生長獲得最佳條件,可使用至少3倍培養(yǎng)基體積的三角瓶培養(yǎng)細(xì)菌,以提供充足的氧飽和環(huán)境。2 x YT、TB (Terrific Broth)等富營養(yǎng)培養(yǎng)基也可選擇用于高拷貝質(zhì)粒宿主菌的培養(yǎng)。此外,當(dāng)宿主菌株接種到培養(yǎng)基中時(shí)必須加入抗生素進(jìn)行篩選培養(yǎng)。搖床的搖晃速度、溫度和時(shí)間等都會(huì)對(duì)細(xì)菌生長產(chǎn)生重要影響。菌體振蕩培養(yǎng)時(shí)間不應(yīng)過長,過度生長會(huì)使菌體細(xì)胞死亡裂解,導(dǎo)致質(zhì)粒 DNA丟失或變異。為了提取高質(zhì)量的質(zhì)粒,需要找到細(xì)菌擴(kuò)增繁殖的最優(yōu)條件。
 
 內(nèi)毒素去除 
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上存在的一類脂多糖物質(zhì)的總稱,單位用EU表示。內(nèi)毒素在細(xì)菌細(xì)胞生長過程中會(huì)有少量內(nèi)毒素釋放,當(dāng)細(xì)胞大量死亡或裂解時(shí)會(huì)釋放出大量內(nèi)毒素。游離的內(nèi)毒素分子會(huì)激活哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此,對(duì)于內(nèi)毒素敏感細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn),需要在制備質(zhì)粒時(shí)盡可能清除內(nèi)毒素,以保證較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和排除內(nèi)毒素對(duì)活體實(shí)驗(yàn)的干擾。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求的不同,選擇相對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒提取試劑盒可事半功倍。濟(jì)凡質(zhì)粒大提試劑盒,引入了可選擇的內(nèi)毒素清除步驟,以滿足不同的質(zhì)粒應(yīng)用場(chǎng)景。對(duì)于內(nèi)毒素非敏感細(xì)胞,可直接省掉內(nèi)毒素清除步驟;而對(duì)于內(nèi)毒素敏感細(xì)胞,可選擇加入內(nèi)毒素清除步驟,一盒兩用,簡單方便。
 
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  提取與純化操作 

裂解細(xì)菌細(xì)胞并釋放質(zhì)粒的方法有很多,如煮沸法,梯度離心法、堿裂解法等。由于堿裂解法操作簡單,且處理方式溫和,市面上應(yīng)用較多。要獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA,一定不能忽略菌體裂解步驟,在加入SDS-NaOH后不要?jiǎng)×艺鹗,容易?dǎo)致質(zhì)粒DNA斷裂,影響完整性,且易混入小片段基因組DNA,影響質(zhì)粒純度。純化質(zhì)粒目前已發(fā)展出多種方法,如鹽析法、硅膠介質(zhì)吸附法,陰離子交換樹脂法等,鹽析法一般涉及有毒試劑,操作并不友好。陰離子交換樹脂法獲得的質(zhì)粒得率和純度都較好,但成本較高。使用比較廣泛的是硅膠介質(zhì)吸附法,該方法制備的質(zhì)粒得率、純度都較優(yōu),成本也相對(duì)較低,可滿足大部分客戶需求。質(zhì)粒純化時(shí)需要考慮不同產(chǎn)品中吸附柱對(duì)質(zhì)粒DNA的吸附能力,若樣本質(zhì)粒量很大,可分多次分離純化。漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體,確保質(zhì)粒中無乙醇?xì)埩。?jì)凡質(zhì)粒提取試劑盒具有較優(yōu)的菌體裂解性能和質(zhì)粒純化性能。
 

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  保存方法 

提取后的質(zhì)粒除了本身質(zhì)量外,也應(yīng)注意提供適宜的保存環(huán)境,以防止質(zhì)粒降解影響下游應(yīng)用,一般質(zhì)?杀4嬗赥E溶液中,在4℃短期保存,在-80℃或-20℃中長期保存。除了直接保存質(zhì)粒,還應(yīng)將含質(zhì)粒的宿主菌保存于甘油中,-80℃或液氮中可長期保存。

當(dāng)然,除了以上介紹的操作要點(diǎn)之外,一款操作方便、提取效率高的試劑也是必不可少的。濟(jì)凡生物是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和技術(shù)服務(wù)為一體的國家高新生物技術(shù)企業(yè),致力于為科研、工業(yè)醫(yī)療以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供穩(wěn)定可靠、高性價(jià)比的產(chǎn)品解決方案和專業(yè)技術(shù)服務(wù)。濟(jì)凡質(zhì)粒大提試劑盒經(jīng)研發(fā)精心設(shè)計(jì)優(yōu)化,可以大幅提高質(zhì)粒提取質(zhì)量,解決客戶實(shí)驗(yàn)中可能遇到的得率低,純度低,內(nèi)毒素高等問題,是當(dāng)之無愧的實(shí)驗(yàn)好幫手。

FinePure無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(升級(jí)版)

  • 得率高、純度好:獨(dú)特的玻璃纖維素膜吸附技術(shù),高效專一結(jié)合質(zhì)粒DNA;
  • 內(nèi)毒素清除步驟靈活:含內(nèi)毒素清除Buffer,根據(jù)下游不同需求可選擇性加入或去掉該步驟,操作簡單方便,適用范圍廣;
  • 時(shí)間短:整個(gè)提取過程50min左右;
  • 應(yīng)用廣:提取的質(zhì)?蓾M足下游克隆、酶切、測(cè)序和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)
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