關于細胞標記和熒光素酶的特性，你了解多少？快搭上學霸問答順風車，跟我們一起儲備知識量吧！

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什么是熒光素酶

熒火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)和海腎熒光素酶(Rellina Luciferase)組成雙熒光素酶報告基因實驗系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay）。通過加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應過程中會發(fā)出生物熒光，然后可以通過化學發(fā)光儀測定反應過程中釋放的生物熒光，從而比較不同組間基因表達的差異。中喬新舟用的是螢火蟲熒光素酶，renilla是海腎。

 

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下面給大家普及一下可能會遇到的問題：

1.在體外的細胞培養(yǎng)中，為什么要經常用抗生素篩選？

1.在體外的細胞培養(yǎng)中，為什么要經常用抗生素篩選？體外培養(yǎng)過程中，不篩選也可以，只要時間不是很長， 接種代數(shù)不要很多。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)基因丟失的情況。但若接種的代數(shù)過多，建議用藥物篩選一段時間或從原始的細胞株培養(yǎng)以保證細胞發(fā)光的強度，中喬新舟的LUC 、GFP 、RFP及雙標記都使用puro抗性篩選。

‍2.底物熒光素(Luciferin）是如何進入小鼠體內的？需要多少？

熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進入小鼠體內的，約一分鐘就可以擴散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，擴散較慢，開始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長。若進行熒光素靜脈注射，擴散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間很短。大部分發(fā)表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg 。20克的小鼠約需3mg的熒光素。

3.熒光素酶的發(fā)光特性如何？

通過腹腔注射老鼠后約一分鐘左右熒光素酶就開始發(fā)光，通常十分鐘后強度達到穩(wěn)定的最高點。在最高點通常持續(xù)約20-30分鐘后開始衰減，約三小時后發(fā)光全部消失。通常最好的檢測時間是在注射后15 - 35分鐘之間，但建議實驗人員在做不同實驗模型前進行連續(xù)時間點發(fā)光曲線的繪制，以確定最高穩(wěn)值的時間范圍。

 

4. 如何保證熒光素酶（Luciferase）的穩(wěn)定性？

熒光素酶基因是插到細胞染色體上的，當細胞分裂、轉移、分化時, 熒光酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。

 

5. 標記的腫瘤接種以后，會發(fā)生 Luciferase 的丟失嗎？

丟失的可能性及量非常小，不會影響實驗結果。有一些實驗報道的結果中，標記的細胞在動物體內存活幾年的時間還可以持續(xù)發(fā)光，說明 Luciferase 基因的標記非常穩(wěn)定。

 

6. 可以用腫瘤塊而不是細胞接種嗎？

可以先用標記的細胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進行原位接種。

 

7. 標記細胞與標記基因所用的啟動子有何不同？

標記細胞一般用在細胞內能穩(wěn)定表達的啟動子, 顯示細胞的數(shù)目。標記基因一般用此基因的啟動子，與此基因平行表達, 顯示此基因的表達數(shù)目，中喬新舟使用的啟動子是CMV。

 

8. 熒光素酶的表達高低與所用啟動子的活性有關嗎？

有關，啟動子的活性高，則熒光素酶的表達高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達低。

 

9. 常用的熒光素酶？特性如何？

熒光素酶，Luciferase 和 Renilla 熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是 D-luciferin，后者的底物是 coelentarizine 。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在 540-600nm，后者所發(fā)的光波長在 460-540nm 左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內的代謝比前者快。大部分的發(fā)表文章通常使用前者用作報告基因， 也有一些文章使用兩者進行雙標記。

 

10.  組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？

可以，但熒光酶的體外活性保持時間比較短， 約幾十分鐘。有相關的文獻。

 

 

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都有哪些細胞株提供
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中喬新舟luc標記細胞部分現(xiàn)貨清單如下：

 

圖1. PC-9和PC-9-gfp-luc細胞傳代后Luciferase熒光值檢測結果

注：

1.建議后期用含puro（2~4ug/ml）的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)；

2.強烈建議收到細胞后先進行細胞體外分析，及時向我們反饋；

3.由于本實驗室沒有進行動物實驗檢測，請務必在動物實驗前再次進行細胞體外分析，以免耽誤實驗；

4.檢測試劑盒使用Promega Bright-Glo Luciferase Assay System。

 

可以提供luc標記的定制服務 周期是3-4周 ‍