重組腺相關(guān)病毒（recombinant Adeno-associated virus，rAAV）是在腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）的基礎(chǔ)上，通過(guò)工程改造得到的一種病毒載體，可在體內(nèi)或體外中高效地遞送外源基因，在基因治療和科學(xué)研究等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。早在1995年便有研究人員使用rAAV治療囊性纖維化疾病。近年來(lái)，多款基于rAAV載體的基因治療藥物獲得美國(guó)食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)，用于治療遺傳性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良和脊髓性肌萎縮癥。同時(shí)，在活體成像、神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記、基因敲除、基因敲入和基因編輯等方向，rAAV載體的應(yīng)用為廣大科研人員實(shí)現(xiàn)基因操作等目的提供了便利。

雖然rAAV載體取得了一些成功，但是也面臨較多的問(wèn)題與挑戰(zhàn)。比如包裝容量較低、某些特定組織或細(xì)胞的靶向性不佳、部分血清型的產(chǎn)量較低等，都亟需解決。通過(guò)優(yōu)化rAAV載體的設(shè)計(jì)和改造衣殼，科研人員逐漸找到解決上述難點(diǎn)的方法。下面給大家介紹rAAV載體的應(yīng)用痛點(diǎn)和rAAV載體設(shè)計(jì)與衣殼優(yōu)化改造的思路。

      

一、rAAV載體的應(yīng)用痛點(diǎn)

⭐ 包裝載量低

rAAV一般只能裝載5kb以下的基因片段，超出這個(gè)容量，rAAV的出毒量與活性往往大大降低。然而無(wú)論用于基因治療的片段或科學(xué)研究上的基因長(zhǎng)度，有不少被遞送的基因片段大小大于5kb，這大大限制了我們的應(yīng)用。

⭐ 體內(nèi)預(yù)存免疫，降低rAAV有效性

現(xiàn)有的科學(xué)研究已經(jīng)證明，40%～80%的人有針對(duì)rAAV的中和抗體。由于體內(nèi)預(yù)存免疫中和抗體的存在，rAAV侵染靶細(xì)胞的效率會(huì)受到限制。因此，目的片段的表達(dá)將會(huì)受到影響。

⭐ 組織靶向性不佳

針對(duì)某些細(xì)胞或組織，部分rAAV血清型的靶向性較差或沒(méi)有合適的血清型。由于rAAV的吸附、入侵、胞內(nèi)運(yùn)輸、蛋白酶體降解、入核、脫衣殼等步驟都與衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)相關(guān)，所以衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)是影響rAAV靶向特異性的一個(gè)重要因素。

⭐ 轉(zhuǎn)導(dǎo)能力低、安全性風(fēng)險(xiǎn)高

部分rAAV血清型的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力低，往往需要較高劑量才能實(shí)現(xiàn)目的基因的遞送。但會(huì)導(dǎo)致治療基因在肝臟富集，產(chǎn)生肝毒性。而rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力是與衣殼蛋白高度相關(guān)。

⭐ 產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高

作為基因治療藥物，要求rAAV的滴度較高。對(duì)于系統(tǒng)性用藥，還需要高劑量給藥。但rAAV的產(chǎn)量低，且不同血清型的產(chǎn)量不同。這也是rAAV在基因治療領(lǐng)域中的一個(gè)應(yīng)用難點(diǎn)。已有研究表明，衣殼蛋白對(duì)rAAV產(chǎn)量有很大影響。

  

二、rAAV載體設(shè)計(jì)和衣殼優(yōu)化改造

⭐ rAAV載體設(shè)計(jì)優(yōu)化

通過(guò)優(yōu)化rAAV載體的設(shè)計(jì)，能在一定程度上擴(kuò)大rAAV的裝載容量、提高靶向性和降低免疫原性。對(duì)于長(zhǎng)度過(guò)大的基因片段，可以利用rAAV基因組能通過(guò)ITR序列或重疊序列之間的同源重組連接成多聯(lián)體的特性，將目的片段拆分成多個(gè)小片段，并包裝成兩個(gè)或多個(gè)rAAV病毒，這樣便可以擴(kuò)大遞送片段的長(zhǎng)度。

特異性啟動(dòng)子能使目的基因在特定的組織和細(xì)胞類型中表達(dá)，但一般而言特異性啟動(dòng)子的活性比CMV等廣譜型病毒啟動(dòng)子的低。將特異性啟動(dòng)子與增強(qiáng)子序列結(jié)合，可提高特異性啟動(dòng)子的活性。例如，在hAAT啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上結(jié)合了肝臟特異性增強(qiáng)子ApoE，能有效提高目的基因在肝臟的表達(dá)水平。此外還可以縮短啟動(dòng)子的長(zhǎng)度，以此擴(kuò)大目的基因的裝載容量。

還能通過(guò)在rAAV基因組的3‘UTR區(qū)引入組織特異性表達(dá)的miRNA的識(shí)別位點(diǎn)，可以有效降低目的基因脫靶的風(fēng)險(xiǎn)和降低免疫原性。比如引入肝臟特異性表達(dá)miRNA122a的結(jié)合位點(diǎn)，可有效降低肝臟中目的基因的表達(dá)。

⭐ rAAV衣殼優(yōu)化改造

衣殼蛋白對(duì)rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力、靶向性、免疫原性和產(chǎn)量有著重要的影響，因此科研人員希望通過(guò)優(yōu)化改造rAAV的衣殼蛋白，從而改善rAAV的適用性�，F(xiàn)今，rAAV衣殼的優(yōu)化改造有四種策略，分別是天然發(fā)現(xiàn)、理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化和計(jì)算機(jī)輔助的定向進(jìn)化。

圖1 獲得新型rAAV血清型的主要方法^[6]

    

現(xiàn)有常用的rAAV血清型大多是天然發(fā)現(xiàn)的，但種類較少，難以滿足當(dāng)今的研究需求。因此，不少研究人員從非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等分離出新型的rAAV血清型。但即使通過(guò)天然發(fā)現(xiàn)的方法，rAAV的種類仍然較少，并且存在前者的應(yīng)用問(wèn)題，因此仍需作進(jìn)一步的優(yōu)化改造。

針對(duì)常用的rAAV血清型，在分析其衣殼的結(jié)構(gòu)、侵染過(guò)程、體內(nèi)代謝等方面后，可以通過(guò)理性設(shè)計(jì)的策略改造衣殼，提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)率和靶向特異性。常用的方法是在衣殼蛋白的特定位置進(jìn)行插入和突變修飾。在rAAV衣殼上某些特定的位點(diǎn)插入多肽序列，插入的這些多肽序列不僅不影響rAAV包裝和轉(zhuǎn)染，還能特異識(shí)別特定細(xì)胞類型的表面抗原，從而提高rAAV的靶向特異性。例如在rAAV2的第587位點(diǎn)上插入表達(dá)靶向人內(nèi)皮細(xì)胞的多肽序列，可有效提高rAAV2對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的靶向能力。此外通過(guò)定點(diǎn)突變，改善衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)，也能優(yōu)化rAAV的功能。比如通過(guò)對(duì)rAAV2的衣殼進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)突變，經(jīng)過(guò)篩選有效突變，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)突變型rAAV2的功能得到優(yōu)化。主要體現(xiàn)在免疫中和抗體識(shí)別與中和突變型rAAV2的能力大大降低。通過(guò)理性設(shè)計(jì)策略可以有效優(yōu)化rAAV的功能，但這種策略有較大的缺點(diǎn)，比如依賴科研人員的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)、成功概率低和只能發(fā)現(xiàn)有限的rAAV衣殼變體等。

定向進(jìn)化策略可以很好地解決理性設(shè)計(jì)策略遇到的瓶頸。定向進(jìn)化無(wú)需了解rAAV的作用機(jī)制、衣殼結(jié)構(gòu)等背景，只需通過(guò)隨機(jī)點(diǎn)突變、體外重組等方法構(gòu)建高豐度的基因突變文庫(kù)，再根據(jù)實(shí)際需求對(duì)文庫(kù)給予篩選壓力，經(jīng)過(guò)迭代篩選，富集出目標(biāo)的新型rAAV變體。應(yīng)用定向進(jìn)化的策略，已經(jīng)篩選出較多的rAAV血清型，比如Tervo等得到了可在神經(jīng)元內(nèi)沿軸突逆向運(yùn)輸?shù)耐蛔儓DrAAV2-retro。雖然定向進(jìn)化可以篩選到多種的血清型，但是這種策略技術(shù)門(mén)檻高、周期長(zhǎng)和成本高，在一定程度上限制了血清型的改造。

對(duì)于定向進(jìn)化遇到的瓶頸，“計(jì)算機(jī)輔助定向進(jìn)化”是一個(gè)良好的思路和解決方案。特別是人工智能輔助rAAV衣殼蛋白設(shè)計(jì)的方式，具有高通量、成本低和周期短等優(yōu)點(diǎn)。其大致的過(guò)程是通過(guò)構(gòu)建大型的rAAV載體文庫(kù)并包裝成病毒，經(jīng)過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，并獲得數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練和優(yōu)化AI模型。再根據(jù)實(shí)際需求（高滴度、特異靶向、低免疫原性等），用AI模型預(yù)測(cè)出合適的新型血清型。再經(jīng)過(guò)體內(nèi)體外的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，判斷新型血清型的有效性。AI預(yù)測(cè)模型能為衣殼蛋白的定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)提供參考，大大提高rAAV優(yōu)化改造的成功率。

圖2 基于AI的高效rAAV衣殼蛋白優(yōu)化流程

來(lái)源：DYNO官網(wǎng)

  

三、總結(jié)

rAAV在基因治療和科學(xué)研究等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，但面臨諸如靶向性不佳、轉(zhuǎn)導(dǎo)能力低、體內(nèi)預(yù)存免疫等難題。雖然通過(guò)優(yōu)化載體設(shè)計(jì)能在一定程度上得到解決，但開(kāi)發(fā)新型血清型卻能從根本上突破這些瓶頸。為了全面、有效、快捷、低成本地開(kāi)發(fā)新型血清型，AI輔助定向進(jìn)化這一策略提供了良好的思路。相信在不久的將來(lái)，越來(lái)越多的新型rAAV將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，便于廣大科研人員的研究和造�；�因疾病的患者。

   

四、參考文獻(xiàn)

1. McLean JR, Smith GA, Rocha EM, et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 2014;576:73-78.

2. Greig JA, Wang Q, Reicherter AL, et al. Characterization of Adeno-Associated Viral Vector-Mediated Human Factor VIII Gene Therapy in Hemophilia A Mice. Hum Gene Ther. 2017;28(5):392-402.

3. Della Peruta M, Badar A, Rosales C, et al. Preferential targeting of disseminated liver tumors using a recombinant adeno-associated viral vector. Hum Gene Ther. 2015;26(2):94-103.

4. Lochrie MA, Tatsuno GP, Christie B, et al. Mutations on the external surfaces of adeno-associated virus type 2 capsids that affect transduction and neutralization. J Virol. 2006;80(2):821-834. 

5. Tervo DG, Hwang BY, Viswanathan S, et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 2016;92(2):372-382.

6. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-378.

7. Akil O, Dyka F, Calvet C, et al. Dual AAV-mediated gene therapy restores hearing in a DFNB9 mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A.