ELISA 實驗中，經(jīng)常會遇到樣本測值低的問題，樣本類型包括血清、 血漿、組織勻漿、細胞裂解液等。假設(shè)客戶的操作完全正確，標準曲線良好， 這種情況樣本測值低可從兩方面進行分析：一是樣本本身含量可被檢測，但由 于實驗操作等原因?qū)е聵颖緶y值不在試劑盒檢測范圍內(nèi)；二是分析物在樣品中 本身濃度偏低。下面將從這兩個方面來進行分析導(dǎo)致樣本測值低的因素以及對應(yīng)的解決方案。
1. 樣本本身含量可以被檢測，有哪些原因?qū)е聹y值低呢？
1）、試劑盒的保存
試劑盒要按照規(guī)定的方法保存，實驗者在購買試劑盒時請務(wù)必留心試劑盒 不同組分的保存方法。如優(yōu)爾生的試劑盒建議檢測液 A、檢測液 B、標準品以及 酶標條等儲存在-20 度，而其它標準品稀釋液等儲存在 4 度。
2）、樣本上樣前的準備
這個過程包括樣本的制備、保存以及是否有經(jīng)歷過反復(fù)凍融。樣本的制備 要根據(jù)樣本類型采用不同的方法，血清、血漿與細胞裂解液的制備方法均不同。 保存，包括保存溫度以及保存時間。一般推薦樣本制備后進行分裝后儲存在-20 度或-80 度，儲存時間不宜過久，因為長時間的儲存有可能導(dǎo)致目標蛋白的降解， 致使檢測結(jié)果不理想。最后注意不要反復(fù)凍融，蛋白樣本反復(fù)凍融會導(dǎo)致降解 發(fā)生。
3）、稀釋方案
樣本的稀釋對于實驗的成功至關(guān)重要，稀釋過度以及稀釋不足均有可能導(dǎo) 致樣本的測值低。
稀釋過度：一般情況下客戶都會根據(jù)文獻測值，以及檢測范圍估計一個稀 釋倍數(shù)，優(yōu)爾生的試劑盒在出廠之前也會做大量檢測，對于常規(guī)樣本如血清血 漿，我們也會根據(jù)實驗室樣本測值情況推薦一個稀釋倍數(shù)。但實驗者如果直接 按照估計或推測的稀釋倍數(shù)進行稀釋檢測后，發(fā)現(xiàn)樣本 OD 非常低。這是由于文 獻作者用的樣本，優(yōu)爾生實驗用的樣本與實驗者的樣本會存在一定的差異，這 些測值有一定的參考意義，但如果照搬，可能會導(dǎo)致實驗失敗。所以建議實驗 者在正式試驗前是先做預(yù)實驗確定樣本的有效性以及最佳稀釋倍數(shù)。預(yù)實驗， 可參考文獻，將樣本進行梯度稀釋，最后選取樣本 OD 落在標準曲線中間位置的 點的稀釋倍數(shù)。
稀釋倍數(shù)不夠：鉤狀效應(yīng)，Elisa 實驗中發(fā)生鉤狀效應(yīng)主要是當抗原與抗體 比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，抗原過量稱為后帶效應(yīng)。當樣本中目標物含 量很高，而沒有進行正確的稀釋，就有可能會導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。解決方案依舊 同稀釋過度的解決方案一樣，在正式實驗之前做預(yù)實驗。

2、分析物在樣品中本身濃度偏低
很多時候，客戶操作沒有問題，標準曲線良好，但檢測多次樣本依然不在 檢測范圍。像細胞因子，如 IL-6 需在炎癥刺激情況才會大量產(chǎn)生，一般非炎癥 樣本測值會非常低。針對這種測值比較低的情況，一般建議根據(jù)文獻選取適合 的樣本類型，同時可以選用高靈敏度的試劑盒，優(yōu)爾生針對某些容易出現(xiàn)測值 低的指標都有研發(fā)出高靈敏度的試劑盒，如 IL-6 等。
以上就是實驗者在實驗過程會遇到的樣本測值低的部分原因，以及一些分 析以及解決方法。當然，具體問題還需具體分析。成功的 Elisa 實驗依賴于質(zhì) 量過硬的試劑盒，恰當處理的樣本以及良好的操作技能。