ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：

1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。

2、研究抗酶抗體的合成。

3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。

4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

 組成 :

試劑盒組成      48孔配置            96孔配置            保存

說明書             1份                1份  

封板膜          2片（48）          2片（96）   

密封袋             1個(gè)                1個(gè)  

酶標(biāo)包被板        1×48             1×96            2-8℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品          0.3ml×6瓶         0.3ml×6瓶         2-8℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液    3ml×1瓶           6ml×1瓶           2-8℃保存

檢測抗體-HRP    5ml×1瓶           10ml×1瓶          2-8℃保存

顯色劑A液      3ml×1瓶           6ml×1瓶           2-8℃保存

顯色劑B液      3ml×1瓶           6ml×1瓶           2-8℃保存

終止液          3ml×1瓶           6ml×1瓶           2-8℃保存

20*洗滌緩沖液   25ml×1瓶          15ml×1瓶          2-8℃保存


需自備的設(shè)備及試劑：

1.450±10nm濾光片酶標(biāo)儀（建議儀器使用前預(yù)熱）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3.Eppendorf 移液器.

4.蒸餾水或去離子水.

5.脫脂棉吸水紙.

6.37℃恒溫箱.

7.100ml和1000ml量筒.

8.準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.

 
注意事項(xiàng)

1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存。實(shí)驗(yàn)操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2．加樣：加樣時(shí)，要控制加樣速度，避免*孔與zui后一孔之見的時(shí)間間隔過大，否則將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時(shí)間，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性；一般加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)，如果樣本數(shù)量過多，可使用多道移液器。

3.孵育：樣品要在密閉的容器內(nèi)進(jìn)行孵育，嚴(yán)格按照說明書上規(guī)定的孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行。

4.洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中的殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，10分鐘左右)，如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

6.建議實(shí)驗(yàn)前預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，計(jì)算結(jié)果時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

7.建議使用本試劑盒時(shí)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)(即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，試用幾個(gè)標(biāo)本)，如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商，如果因運(yùn)輸過程導(dǎo)致試劑盒失效，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失。

 
操作步驟

1. 取出試劑盒，于室溫(20-25℃)放置15-30分鐘。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在室溫(20-25℃)內(nèi)進(jìn)行。

2. 取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。

3. 空白微孔中加入50μl的樣品，空白對照加入50μl的蒸餾水；

4. 在樣品孔中加入10μl的生物素；(不含空白對照孔,切忌：生物素只加樣品孔！)

5. 在各孔中加入100μl的酶標(biāo)記溶液；(不含空白對照孔)

6. 將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng) 1小時(shí)；(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)

7. 充分清洗酶標(biāo)板3-5次，保持各孔有充足的水壓；(濃縮洗滌液以1：100的比例與蒸餾水稀釋)

8. 酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干；

9. 各孔加入顯色劑A、B液各50μl；(不含空白對照孔)

10. 20-25℃下避光反應(yīng)15分鐘；

11.各孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)；

結(jié)果判斷

1. 30分鐘內(nèi)在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；

2. 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖；

3. 根據(jù)樣品的OD值查找對應(yīng)的濃度范圍；