各位老師在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，肯定會(huì)遇到以下問(wèn)題：

     ● 細(xì)胞越長(zhǎng)越多
     ● 買(mǎi)的細(xì)胞比較貴重
     ● 節(jié)假日無(wú)法照看細(xì)胞
     ● 實(shí)驗(yàn)不順暢需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

這時(shí)，我們就需要適當(dāng)?shù)谋４嬉恍┘?xì)胞，也就是凍存細(xì)胞。 
 

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。

利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。 

在不加任何保護(hù)劑的條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。 如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

 

   細(xì)胞凍存復(fù)蘇遵循的原則是：慢凍快融慢凍大家可參考之前的文章：   今天我們來(lái)聊聊，細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)需要注意的那些事兒。細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

 

01、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

     1. 將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃
     2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線(xiàn)照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面，保證無(wú)菌。
     3. 在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

02、取出凍存管

     1. 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對(duì)應(yīng)編號(hào)。
     2. 從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

03、迅速解凍

     1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。
     2. 約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

04、平衡離心

     1. 用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3分鐘。

05、制備細(xì)胞懸液

     1. 吸棄上清液。
     2. 向離心管內(nèi)加入10ml完全培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
     3. 用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

06、細(xì)胞計(jì)數(shù)

     1. 細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

07、培養(yǎng)細(xì)胞

     1. 將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞情況而定。

08、記錄復(fù)蘇日期

 

“ Note

注意事項(xiàng)

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面最容易出現(xiàn)問(wèn)題的部分，因此我們幫您總結(jié)以下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)，幫助您更好的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作：     

     1. 注意無(wú)菌操作。
     2. 取細(xì)胞的過(guò)程中可能會(huì)接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。
     3. ☆此項(xiàng)尤為重要，如果凍存管密封不嚴(yán)，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸，所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套。
     4. 應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)溫速度太慢，則會(huì)造成細(xì)胞損傷。另外，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性。
     5. 細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃水箱中取出的細(xì)胞在最短的時(shí)間內(nèi)放入水浴鍋中進(jìn)行解凍。
     6. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少其對(duì)細(xì)胞的損傷。
     7. 細(xì)胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15ml培養(yǎng)液，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。
     8. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過(guò)多，細(xì)胞濃度過(guò)低，不利于細(xì)胞的貼壁。
     9. 加培養(yǎng)基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒(méi)有什么影響。還有一個(gè)說(shuō)法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。  

 

 初學(xué)者易犯錯(cuò)誤

     1. 水浴鍋未提前預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。
     2. 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。
     3. 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。
     4. 一次復(fù)蘇細(xì)胞種類(lèi)過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

 

解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長(zhǎng)環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡，像水土不服一樣。

 

結(jié)果分析

判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。

如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說(shuō)明細(xì)胞復(fù)蘇的過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長(zhǎng)，達(dá)到正常的生長(zhǎng)特性（比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲(chǔ)存數(shù)量。

本文部分內(nèi)容來(lái)源：百度文庫(kù)

 

 

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