Protein Engineer對很多人來說，檢測蛋白質(zhì)的濃度實在不是多困難的實驗。但有時我們也不能太過自信，因為即使最簡單的方法都有其復(fù)雜的機理。為了幫助大家選擇正確并且簡單的方法測定蛋白質(zhì)的濃度，小編在這里簡單介紹下三種常用的蛋白質(zhì)含量測定方法的原理及注意事項。

一、BCA（Bicinchoninic Acid）法
BCA方法是近年來廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)定量方法。其原理是，在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與二價銅離子絡(luò)合并將二價銅離子還原為一價銅離子。BCA與一價銅離子結(jié)合形成穩(wěn)定的藍(lán)紫色復(fù)合物。該復(fù)合物在562 nm處有較高的吸光值，并與蛋白質(zhì)濃度呈正比。不方便的是這種方法需要提前制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。BCA蛋白質(zhì)測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質(zhì)濃度檢測，可兼容高達(dá)5%的SDS，TritonX-100及Tween等。然而，由于BCA方法依靠銅離子進(jìn)行顯色反應(yīng)，如果溶液中含有與銅離子反應(yīng)的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、β-巰基乙醇，結(jié)果將受到很大程度的影響。同時，BCA方法的檢測結(jié)果也會受到蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影響。

二、Bradford法
Bradford方法是由Bradford于1976年建立的。第一篇描述Bradford方法的文獻(xiàn)目前已經(jīng)被引用數(shù)千次，這充分說明了Bradford方法的價值。該方法的原理是，帶負(fù)電的考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用�？捡R斯亮藍(lán)在溶液中顯紅色，吸收峰在465nm處，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其顯藍(lán)色，在595nm處有吸收峰。595nm處的吸光值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比。在應(yīng)用Bradford方法時有一些注意事項，如下：

1、利用Bradford方法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線并非是直線
上圖標(biāo)準(zhǔn)曲線采用賽默飛Bradford蛋白質(zhì)檢測試劑盒（Cat：23200），BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品制作。從圖中可知BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線形部分只在0.1-1.4 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)。因此需要將待測蛋白質(zhì)濃度稀釋或濃縮至這一濃度區(qū)間，方可利用線形擬合的公式計算蛋白質(zhì)濃度。另外，有必要在每次實驗時都進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

2、高濃度去垢劑影響B(tài)radford方法的準(zhǔn)確性
對Bradford方法有干擾的試劑及其濃度可以從BioEngX分享的protocol中了解，平臺回復(fù)Bradford可獲得protocol下載鏈接。這里列舉幾個常用的試劑及Bradford方法最大兼容濃度：SDS，最大兼容濃度為0.125%; Tween-20(80), 最大兼容濃度0.061%；咪唑（pH 7.0） , 最大兼容濃度200 mM; HEPES（pH 7.5）,最大兼容濃度100 mM。值得一提的是咪唑，利用鎳柱純化蛋白質(zhì)時，洗脫緩沖溶液中有高濃度的咪唑，因此在利用Bradford對純化蛋白質(zhì)進(jìn)行定量前，必須要對洗脫蛋白質(zhì)進(jìn)行脫鹽處理。 值得第二提的是，不像BCA方法，Bradford方法與還原性試劑是兼容的。當(dāng)你需要在蛋白質(zhì)中添加DTT 等還原性保護(hù)試劑時，不要猶豫，Bradford是你絕佳的選擇。

3、可利用除了595 nm以外的波長進(jìn)行檢測
Bradford方法能夠利用96孔板檢測體積低至5 μL的蛋白質(zhì)濃度，然而很多plate reader不具備595 nm的濾光片。這里要說明的是，蛋白質(zhì)與染料產(chǎn)生的藍(lán)色復(fù)合物可以利用570-610 nm之間的任何波長檢測到。只不過，利用除了595 nm以外的波長制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率會比595nm下的標(biāo)曲斜率小，同時最低檢測限也會有所提高。

三、紫外分光光度法
簡單但常常不可靠。這個方法通過測量蛋白質(zhì)中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸在280nm處吸光值來估測蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)濃度根據(jù)Beer-Lambert定律計算。
                  

A=E•C•l
A代表吸光度，E代表消光系數(shù)，C代表蛋白質(zhì)濃度，l代表光徑長度。消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列估測。這種方法之所以不可靠有兩個原因。
第一，不同的蛋白質(zhì)含有不同的酪氨酸和色氨酸含量。故要準(zhǔn)確測量，必須要有待測蛋白質(zhì)的純品作為參考。
另外，這種方法會受到在280 nm處有吸光值的物質(zhì)的影響，包括一些buffer離子，核酸，乙醇等等。其中尤以核酸的影響最為嚴(yán)重。核酸的最大吸收峰在260 nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD260和OD280，然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經(jīng)驗公式校正，以消除核酸的影響。本法操作簡單迅速，且不消耗樣品，多用于純化的蛋白質(zhì)的微量測定。