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細胞把脈-細胞的狀態(tài)分析與解決操作方法

瀏覽次數(shù)：1568　發(fā)布日期：2021-11-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

細胞養(yǎng)著養(yǎng)著就變樣了，狀態(tài)不好“生病了”，怎么辦？
教您細胞界的“望、聞、問、切”，給您的細胞“把把脈~”

細胞狀態(tài)不好，總結下來可以從以下幾點出發(fā)考慮：

導致細胞污染的原因主要有以下幾方面：
1. 環(huán)境：水浴鍋、培養(yǎng)箱水盤、細胞培養(yǎng)箱內(nèi)壁、超凈臺、桌面及試劑瓶身、細胞房空氣消毒。
2. 操作：細胞復蘇、傳代、凍存等過程中也可帶入污染。
3. 試劑：血清、基礎培養(yǎng)基、胰酶、輔助試劑、營養(yǎng)添加物等。
4. 耗材：培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、槍頭。
5. 細胞本身：本身攜帶污染、細胞老化、分化等。
接下來我們按照此步驟一步步進行分析：

環(huán)境
環(huán)境需要考慮到的因素有：

水浴鍋、培養(yǎng)箱水盤

由于長期處于潮濕狀態(tài)，水是一個很重要的污染源，建議兩周更換一次高壓滅菌水。并且添加水浴鍋專用消毒預防試劑（Aquaguard-2，貨號: 01-916-1E）和培養(yǎng)箱水盤（Aquaguard-1，貨號: 01-867-1B）專用消毒預防試劑。

Aquaguard-1
用來消毒培養(yǎng)箱中的水盤，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無毒；對不銹鋼無腐蝕性；不揮發(fā)。

用法：
1. 培養(yǎng)箱建議每兩周進行一次系統(tǒng)地清潔和消毒。
2. 稀釋100倍即可使用，即將1L水中加入10ml的Aquaguard-1溶液。

Aquaguard-2
用來消毒水浴鍋，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建議每周進行一次系統(tǒng)地清潔和消毒水浴鍋。
2. 稀釋500倍即可使用，即將1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。

細胞培養(yǎng)箱內(nèi)壁
每星期需要清潔一次，保持潔凈狀態(tài)。每年對CO₂、溫度探頭校準一次。
超凈臺、桌面及試劑瓶身
要經(jīng)常擦拭，以防帶入外源污染。
細胞房空氣消毒
可選擇紫外殺菌、高錳酸鉀-甲醛熏蒸、過氧化氫-過氧乙酸干霧滅菌、臭氧滅菌等方法徹底清潔細胞房空氣，每種方式各有優(yōu)缺點、可綜合考慮及比較后擇優(yōu)使用。

培養(yǎng)箱內(nèi)壁、超凈臺、桌面及試劑瓶身都可考慮使用：

Pharmacidal™ Sprays and Solution 消毒噴壺溶液

主要成分：Pharmacidal 是由篩選過的有機氮化合物組成，主要組成成分為：芐基二甲基辛基氯化銨、芐索氯銨、氯化芐乙基銨、三羥乙基胺，并添加丙二醇等清潔消毒劑。

作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂質(zhì)變性，分解細胞膜的雙層磷脂質(zhì)和增加細胞通透性，導致酶的滅活，蛋白質(zhì)沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應。

特點：
1. Pharmacidal 對大部分的細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
2. 不含汞、甲醛、苯酚和酒精，可生物降解、無毒、無刺激，對一般的工作臺面和器材沒有腐蝕性和任何損傷。

使用方法：
1. 可消毒橡膠手套、超凈臺面、桌面、顯微鏡臺、試劑瓶身等物體表面，噴涂完全濕潤，不需擦拭，自然風干。
2. 培養(yǎng)箱內(nèi)壁噴涂完全濕潤后，等待10分鐘，用無菌吸水紙吸干內(nèi)壁上的殘留液體。

操作
操作過程中人是最大的一個污染源，人類1個小時會脫落3*10⁴-4*10⁴個細胞；24小時會脫落10⁸個細胞，1年會脫落3.6kg的死細胞。從人身上掉落的顆粒達到10⁴/min（顆粒直徑0.5μm）。

人	腳	100-1000 個微生物/cm²
	頭皮	10⁶個微生物/cm²
	額頭	10⁵個微生物/cm²
	噴嚏	10⁴ – 10⁵個微生物
	唾液	10⁷個微生物/mL
無菌服	6小時后	1 – 6個微生物/cm²
空氣	戶外	100 – 500個微生物/m³
空氣	戶內(nèi)	500 – 2000個微生物/m³

人類的皮膚總面積約2m²，生活約10¹²個微生物；我們1g的排遺物中約有10¹²個微生物。

如何進行污染源排查？
可通過控制變量法對整個培養(yǎng)操作流程進行分析：培養(yǎng)試劑及輔助試劑等條件不變，重新復蘇一株細胞，復蘇時水浴要注意水浴不能沒過凍存管瓶蓋，傳代時不能觸碰吸管尖頭部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭無菌操作臺面。觀察細胞是否有污染現(xiàn)象。

試劑
☆ 空培不能用于污染來源排查

分別空培胰酶、PBS、凍存液、高壓水。即便存在污染，但是由于營養(yǎng)（碳源、氮源、無機鹽、生長因子）不完全，不一定會像實驗中那樣長出菌斑。
空培血清時，因為血清中富含蛋白，空培過程中會有沉淀產(chǎn)生，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，沉淀會逐漸增多，而這些沉淀往往會被誤以為是污染。
空培完全培養(yǎng)液（血清+基礎培養(yǎng)基）時，首先要會區(qū)分沉淀和污染。因此對經(jīng)驗要求高。其次，若完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后有污染出現(xiàn)，也不好判斷是血清還是基礎培養(yǎng)基，或者是操作過程中帶入的污染。

如何進行污染源排查？

血清：其他試劑保持不變，僅更換血清。
基礎培養(yǎng)基：其他試劑保持不變，僅更換基礎培養(yǎng)基。
PBS：其他試劑保持不變，僅更換PBS。
胰酶：若細胞復蘇的很好，一傳代就污染，可以嘗試其他試劑保持不變，更換消化用胰酶，看細胞狀態(tài)。

細胞反復復蘇都會出現(xiàn)污染，那可保持培養(yǎng)體系不變，培養(yǎng)其他類型且適用于此培養(yǎng)體系的細胞，觀察是否有污染出現(xiàn)。整個營養(yǎng)體系：基礎培養(yǎng)基、血清、營養(yǎng)添加物都可使用控制變量法進行排查。