恩替卡韋、替諾福韋和丙酚替諾福韋（ETV、TDF和TAF）是2019版中華醫(yī)學(xué)會(huì)的《慢性乙型肝炎防治指南》推薦乙肝患者首選的強(qiáng)效低耐藥藥，隨著ETV大量使用，在真實(shí)世界中耐藥發(fā)生情況到底是怎樣的呢？我們通過(guò)對(duì)5篇乙肝耐藥相關(guān)文獻(xiàn)的解讀，研究真實(shí)世界的耐藥發(fā)生情況和特點(diǎn)。文獻(xiàn)解讀的上篇我們分析了302醫(yī)院8年的耐藥數(shù)據(jù)和北京佑安醫(yī)院8年大數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)都顯示ETV耐藥檢出率逐年提升。本期我們帶來(lái)一組新數(shù)據(jù)，繼續(xù)研究ETV的耐藥發(fā)生率和新的耐藥突變形式。

文章收集了自2011年至2017年的持續(xù)HBV病毒血癥（抗病毒治療48周后，血清的HBV DNA持續(xù)大于100IU/ml）或者發(fā)生病毒學(xué)突破患者；使用測(cè)序方法學(xué)進(jìn)行耐藥檢測(cè)，檢測(cè)出L180M+M204V/I±rtT184A/C/F/G/I/L/S±rtS202G±rtM250L/V判定為ETV基因型的耐藥位點(diǎn)。^[3]

本研究共篩選到72例ETV耐藥案例，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在所有耐藥案例中ETV的耐藥所占比例從2011年的6.04%上升至2017年的15.02%。

隨著臨床上ETV耐藥患者逐年增加，耐藥變異形式變的復(fù)雜多樣，除了經(jīng)典的耐藥變異形式，不斷有新的新ETV耐藥變異體產(chǎn)生。2015 年日本學(xué)者在Journal of Hepatology 上首次報(bào)道在1 例ETV治療失敗患者檢出一種新型ETV耐藥突變r(jià)tL180M+A186T+M204V。

本研究共納入12708例慢性乙型肝炎患者，4047例(31.85%)有ETV用藥史，直接測(cè)序法檢出795例發(fā)生經(jīng)典ETV耐藥，分別占總?cè)藬?shù)和ETV用藥人數(shù)的6.26%(795/12708)和19.64%(795/4047)，其中7例(0.06%)檢出rtA186T突變，占ETV治療患者的0.17%(7/4047)。
 

文章對(duì)HBVrtA186T突變株的復(fù)制力和藥物敏感性進(jìn)行了分析，病毒復(fù)制力檢測(cè)顯示，rtL180M+A186T+M204V突變株的復(fù)制力顯著低于野生株，僅為野生株的13.3%(P<0.05)；耐藥表型分析結(jié)果顯示，rtL180M+A186T+M204V突變株對(duì)ETV的耐藥倍數(shù)是野生株的210.2倍。(EC50比值為0.14/0.000666，圖2A)，但對(duì)TDF仍敏感，EC50比值為1.76倍(3.83/2.17，圖2B)。^[4]

本研究通過(guò)分析臨床大樣本數(shù)據(jù)和體外實(shí)驗(yàn)證明，rtL180M+A186T+M204V為ETV的一種新型耐藥突變，但臨床檢出率低，與突變株復(fù)制力明顯降低相關(guān)。

本研究統(tǒng)計(jì)到發(fā)生ETV的耐藥總檢出率為5.69% (1,252/22,009)，在具有ETV的服藥史或暴露史患者中檢出率為20.29%(1,252/6,170)；這1,252例患者中只有17例患者沒(méi)有其他NAs藥物的暴露史，如LAM和LdT。通過(guò)序列分型共有18例患者血清中檢測(cè)出A181C的突變，在總患者人群和ETV用藥史人群中的比率為0.08%和.29%。

對(duì)5名具有A181C患者治療過(guò)程中隨訪時(shí)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清樣本的各個(gè)指標(biāo)分析，ETV治療階段病毒學(xué)突破時(shí)耐藥檢測(cè)均檢出了不同比率的A181C的突變株。^[5]

文章對(duì)含有A18C的突變株進(jìn)行復(fù)制能力和耐藥性進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。相對(duì)于野生型相比，rtL180M + A181C + M204V, rtL180M +A181C + M204V + M250V和rtL180M+ A181C + S202G + M204V突變體是野生型復(fù)制能力的45.7%,25.9%,和25.0%，而對(duì)ETV的易感性分別下降85.6，356.1和307.1倍，當(dāng)人為清除rtA181C的突變體時(shí)很大程度恢復(fù)rtL180M+A181C+M204V突變體對(duì)ETV的敏感性。EC50實(shí)驗(yàn)顯示，與野生型相比，突變體EC50增加了70.5倍，這表示相對(duì)野生型增加了70.5倍的耐藥性。文章通過(guò)分析病毒RT區(qū)與ETV結(jié)合的分子模型顯示，rtL180M+A181C+M204V突變體表現(xiàn)出較rtL180M+M204V突變體更加不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

本研究通過(guò)臨床表現(xiàn)、測(cè)序分析和體外實(shí)驗(yàn)顯示rtL180M + A181C + M204V是一種新型非經(jīng)典的ETV耐藥突變形式。

基于以上研究顯示，ETV的真實(shí)世界耐藥檢出率在逐年提升，在近幾年總耐藥患者中接近達(dá)到20%的耐藥患者與ETV相關(guān)；這與目前ETV的逐漸大量使用以及國(guó)內(nèi)有大量既往低耐藥屏障的藥物L(fēng)AM、LdT患者群體存在相關(guān)聯(lián)，這一比例隨著ETV的更多使用會(huì)進(jìn)一步加大。這提示，隨著一線藥物在臨床治療上大量使用，真實(shí)世界的耐藥事件會(huì)逐漸增多，需加以關(guān)注；尤其是對(duì)于具有聯(lián)合用藥史、不明用藥史和既往低耐藥屏障服藥史患者加以耐藥監(jiān)測(cè)，避免因耐藥導(dǎo)致疾病進(jìn)一步進(jìn)展。同時(shí)，最近的一些研究顯示不斷有的ETV的耐藥突變形式出現(xiàn)并證實(shí)。耐藥檢測(cè)的測(cè)序法是最好的方法用于耐藥檢測(cè)，其具有檢測(cè)精準(zhǔn)和位點(diǎn)全面的優(yōu)點(diǎn)，能夠精準(zhǔn)的檢測(cè)出指南中經(jīng)典的多個(gè)耐藥位點(diǎn)，同時(shí)還可以檢測(cè)出對(duì)于新出現(xiàn)的位點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

1、 Jin S, et al. Efficacy of DifferentNucleoside Analog Rescue Therapies for Entecavir-Resistant Chronic Hepatitis BPatients, [J]. BMC Infectious Diseases, Preprint 2020 Version 2,  DOI:10.21203/rs.3.rs-64765/v2

2、劉璐潔,等. 乙型肝炎病毒新型恩替卡韋耐藥突變r(jià)tL180M+A186T+M204V 的鑒定, [J]. Med J Chin PLA,2019, 44(3): 197-202.

3、  Zhou Y, Liu Y, Chen R, et al. HBVrtL180M+A181C+M204V mutations may lead to entecavir resistance in real-lifeclinical practice[ J]. Hepatology, 2017, 66(1 Suppl): 505A.

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乙肝病毒耐藥和分型檢測(cè)（Sanger測(cè)序法）
 

• 檢測(cè)常見的YMDD突變M204V/I，也可以同時(shí)獲得RT逆轉(zhuǎn)錄區(qū)的其他多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)，包括有文獻(xiàn)支持的A181V/T，N236T，I169T，L180M，T184A/G/S/I/L/F，S202G/I，M250V/L/I，V173L，A194T，對(duì)未知耐藥位點(diǎn)和發(fā)生變異的病毒有很好的臨床和科研參考價(jià)值
• 檢測(cè)六種主要乙肝藥物（拉米夫定，替比夫定，恩替卡韋，恩曲他濱，阿德福韋和替諾福韋）的耐藥以及乙肝病毒分型信息
• 分子診斷技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)，耐藥和分型一步到位
• 國(guó)內(nèi)唯一獲得CFDA的Sanger測(cè)序法的乙肝耐藥分析檢測(cè)
• CFDA注冊(cè)證：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401444號(hào)