文章題目：Subtype-Specific Prevalence of Hepatitis C Virus NS5A Resistance Associated Substitutions in Mainland China
作者單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心
發(fā)表刊物：Frontiers in Microbiology （if 4.259，2019）
接收時(shí)間：2019年3月1日

 

丙型肝炎防治指南（2019年版）提到：慢性HCV感染者的抗病毒治療已經(jīng)進(jìn)入直接抗病毒藥物（DAA）的藥物時(shí)代，泛基因型方案在已知主要基因型和主要基因亞型的HCV感染者中達(dá)到90%以上的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR），而對(duì)于未獲得SVR的基因亞型和耐藥相關(guān)替代突變（Resistance associated substitution，RAS）的感染者，還需要規(guī)范的臨床試驗(yàn)和精準(zhǔn)耐藥檢測(cè)來(lái)確定合適的治療方案。

RASs可能引起HCV DAAs抗病毒效能下降，導(dǎo)致治療失敗。有報(bào)道稱NS5A RASs可能影響百立澤（達(dá)拉他韋）+速維普（阿舒瑞韋）、夏凡寧（雷迪帕韋+索磷布韋）等方案的療效等。NS5A RASs在不同地理區(qū)域的不同基因型之間檢出頻率不同，基于大部分RASs的研究集中在1型，這篇文章是分享NS5A RASs不同HCV亞型在中國(guó)的流行情況。

 

材料：

1.廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心收集了2018年1月-6月期間的HCV RNA陽(yáng)性樣本，從這些做HCV基因分型的樣本中隨機(jī)挑選了878例（約1/8）樣本用于NS5A RASs檢測(cè)，所有樣本均記錄了性別和年齡。878例樣本來(lái)自中國(guó)的27個(gè)省，亞型主要為1b：489例，2a：203例，3a：60例，3b：78例，6a：48例。
2. 上海瑞金醫(yī)院收集了2015年4月-2017年9月期間185例未接受DAAs治療的HCV 1b樣本，其中有52例在樣本采集時(shí)有過(guò)干擾素治療的記錄。 

方法：廣州金域的878例樣本使用Sanger測(cè)序法分析，上海瑞金的185例樣本使用Sanger測(cè)序和NGS兩種方法分析。

 

1.研究人群特征——各亞型在年齡和地域分布不均

年齡分布：與1b和2a相比，3a、3b和6a感染在男性和年輕患者中更常見。

地域分布：2a患者多集中在中國(guó)北方，而6a患者多集中在中國(guó)東南部。

 

2.NS5A序列的進(jìn)化分析

3a序列系統(tǒng)上與來(lái)自Los Alamos HCV數(shù)據(jù)庫(kù)的35個(gè)不同地理來(lái)源的參考序列距離較遠(yuǎn)。Cluster1序列主要來(lái)自中國(guó)東部，與2004年從泰國(guó)分離出的一毒株(HM042074)有關(guān)。cluster2序列與2011年從中國(guó)分離到的一個(gè)毒株(KC844041)的親緣關(guān)系更近，并且表現(xiàn)出混合的地理起源，表明該群集在全國(guó)范圍內(nèi)的流行分布。

3b序列呈散在分布，無(wú)地理聚類，cluster3主要來(lái)自中國(guó)東部，但與廣西柳州分離的部分毒株具有高度的相似性，表明西南地區(qū)的3b型別起源和發(fā)展于此，其他地區(qū)的分離株可能是其后代。

 

3.   NS5A RASs在不同亞型的流行率不同

表2中列出了與臨床最相關(guān)的HCV RASs情況：

 

在1b序列中（489例），Y93H約占14.1%，Q24、L28、L31、P32、S38、A92的高度保守。R30和P58的多態(tài)性更高：分別有17.2%和7%的序列含有Q30和S58的替代。

在2a序列中（203例），95.6%的2a受試者發(fā)現(xiàn)了L31M，這表明該氨基酸中的RAS基因頻率較高。Y93位未檢測(cè)到RASs。T24S、F28L、K30R、P58S、C92S所占比例分別低至2.5%、2.5%、1.0%、1.5%、3.0%。

3a的序列中（60例），Y93H僅檢測(cè)到3.3%，未發(fā)現(xiàn)其他RASs。而在3b（78例）中，檢測(cè)到的A30K和L31M突變比例分別為97.4%和98.7%，但未檢測(cè)到Y(jié)93H。

6a（48例）的Q24K/R、L28F和T58S 的比例分別為18.8%、20.8%、6.3%，但未發(fā)現(xiàn)Y93H。

 

多重RASs可能進(jìn)一步降低耐藥屏障，文章分析了臨床重要NS5A RASs在亞型間的重疊率。在1b序列中，未發(fā)現(xiàn)28A/M/T/V + 31F/I/M/V的重疊，28A/M/T/V + 93H/N/S(2/489)或31F/I/M/V + 93H/N/S(1/489)頻率較低(圖A)。但在3b序列(75/78)中，A30K + L31M的共存度極高(圖B)。綜上所述，1b序列中的Y93H、2a序列中的L31M、3b序列中的A30K和L31M是導(dǎo)致NS5A RASs在中國(guó)流行的主要原因（圖C）。

 

 

4.   1b準(zhǔn)種的多樣性

在上表列出的RASs中，Y93H主要與所有亞型的NS5A靶向DAA功效降低有關(guān)。Y93H多在1b中發(fā)現(xiàn)(14.1%)，但在其他亞型中很少見到。Y93和Y93H變異患者在年齡和性別上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從區(qū)域分布來(lái)看，東部地區(qū)的患者Y93H頻率明顯較高(East/non-East, 20.4%/11.0%，p=0.0083)。

為了排除金域的抽樣偏差，瑞金醫(yī)院收集了185例未經(jīng)DAA治療的HCV 1b樣本，采用Sanger測(cè)序和NGS測(cè)序兩種方法對(duì)其NS5A RASs頻率進(jìn)行了測(cè)試。Y93H/N/S在NGS平臺(tái)測(cè)到的累積頻率為31.9% (1% cutoff)，而Sanger平臺(tái)的頻率為20.5%（與金域數(shù)據(jù)一致）。但一般認(rèn)為基線耐藥變異的比例較低(＜15%)不會(huì)顯著影響應(yīng)答，因此文中使用15%作為深度測(cè)序的閾值來(lái)報(bào)告耐藥變異。93H/N/S在1-15%范圍內(nèi)頻率為12%，在＞15%范圍的頻率為19.5%，跟Sanger平臺(tái)的頻率（20.5%）及金域測(cè)的頻率（14.3%）較接近。28A/M/T/V和31F/I/M/V在1-15%范圍的頻率分別為7.6%、3.8%，而在＞15%范圍比例非常少。另外，所有樣本核苷準(zhǔn)種歸一化香農(nóng)熵的直方圖表明出現(xiàn)93H/N/S的患者HCV復(fù)雜性更高。
 

NS5A RASs的流行率可能會(huì)根據(jù)不同HCV的基因型/亞型和治療方案而變得多樣化。HCV 1b序列中的Y93H、2a的L31M，3b的A30K和L31M是導(dǎo)致NS5A RASs在中國(guó)流行的主要原因。對(duì)于未經(jīng)DAA治療的1b患者，病毒復(fù)雜度較高的NS5A 93H發(fā)生率也較高。3b患者對(duì)NS5A抑制劑具有天然耐藥性�；�線NS5A RASs的信息可為臨床治療提供指導(dǎo)。由于NS5A抑制劑的重要作用，不同NS5A抑制劑之間的高交叉耐藥，以及NS5A抑制劑耐藥HCV變異的長(zhǎng)期存在，因此基線NS5A RASs的患者在選擇DAAs時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

本文廣州金域的878例樣本，上海瑞金的185例樣本都使用了Sanger測(cè)序，sanger測(cè)序法是丙肝分型的金標(biāo)準(zhǔn)方法，可提供被測(cè)區(qū)域的全部核苷酸序列/遺傳信息，可以發(fā)現(xiàn)新的基因變異形式，可一次性檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)已知和可能的未知耐藥變異位點(diǎn)，假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，是2019版慢性丙型肝炎防治指南推薦方法。

 

作者及單位介紹

【謝青】

現(xiàn)任瑞金醫(yī)院感染科主任、碩士生導(dǎo)師、上海市肝病研究中心專家委員會(huì)常務(wù)委員、上海市中醫(yī)藥學(xué)會(huì)感染分會(huì)委員、《肝臟》雜志編輯委員會(huì)委員。多年來(lái)主要從事傳染病學(xué)專業(yè)，尤其是病毒性肝炎的臨床和基礎(chǔ)研究。目前作為負(fù)責(zé)人承擔(dān)了兩項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目以及一項(xiàng)上海市高校青年科學(xué)基金項(xiàng)目。

 

【上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院】

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院成立于1907年，是三級(jí)甲等醫(yī)院。上海瑞金醫(yī)院感染科先后主持了國(guó)家“六五”、“七五”及“八五”攻關(guān)課題“重癥肝炎發(fā)病機(jī)制及治療研究”，取得了許多重大成就。目前瑞金醫(yī)院感染科，除繼續(xù)保持了在重癥肝炎研究領(lǐng)域的領(lǐng)先優(yōu)勢(shì)外；在慢性乙型、丙型病毒性肝炎抗病毒治療的優(yōu)化及耐藥檢測(cè)、肝移植術(shù)后乙丙型病毒性肝炎的復(fù)發(fā)、肝細(xì)胞損傷分子機(jī)制及治療干預(yù)等研究方面都居于全國(guó)領(lǐng)先地位。

 

【金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心】

廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)集團(tuán)股份有限公司是一家以第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及病理診斷業(yè)務(wù)為核心的高科技服務(wù)企業(yè)，金域醫(yī)學(xué)嚴(yán)格遵循國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，擁有先進(jìn)的質(zhì)量管理體系。截至2018年，共獲得包括美國(guó)CAP、ISO15189在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外認(rèn)證認(rèn)可證書36張，連續(xù)16年領(lǐng)先行業(yè)。檢測(cè)結(jié)果為全球50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)認(rèn)可。
 

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丙肝病毒基因分型檢測(cè)（Sanger測(cè)序法）
 

• 檢測(cè)HCV病毒6大基因型和70種亞型（含常見的1b，2a，3a，3b，6a）， 指導(dǎo)臨床制定個(gè)性化治療方案
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• CFDA注冊(cè)證：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401445號(hào)