玩轉(zhuǎn)10x之一：
scifi-RNA-seq 借助ATAC試劑盒實現(xiàn)
超高通量單細胞表達譜測序ifi-RNA

       奧地利科學院分子醫(yī)學研究中心 (CeMM) 的研究人員開發(fā)了一種新的單細胞樣品制備方法，single-cell combinatorial fluidic indexing (Scifi)，可將基于10x Chromium Controller平臺單細胞RNA-seq的細胞通量提高15倍，這一成果發(fā)表在5月31日出版的Nature Methods上。
       在常規(guī)基于微滴的 scRNA-seq 中，進入到同一微滴中的兩個細胞將使用相同的細胞標簽標記它們的轉(zhuǎn)錄組，在數(shù)據(jù)分析過程中，這兩個細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將無法區(qū)分，從而產(chǎn)生了有偏差的結(jié)果。為了最大限度地減少雙細胞微滴的比例，需控制上樣細胞數(shù)，使得兩個細胞不太可能進入同一個油包水微滴，大部分的微滴中僅含有Gel bead而不包含細胞。
       為提高油包水微滴的使用效率、釋放其高通量分析的全部潛力，作者在scifi-RNA-seq方法中，首先透化處理細胞或細胞核，將它們的轉(zhuǎn)錄組通過split pools方法在384孔板里反轉(zhuǎn)錄，加上預(yù)索引標簽，隨后包含預(yù)索引標簽cDNA的細胞或細胞核被匯集起來，10x上機制備油包水，生成的大多數(shù)微滴包有多個細胞或細胞核。應(yīng)用10x scATAC Gel bead kit，在油包水內(nèi)部cDNA又被標上10x cell barcode。雖然這兩輪加的標簽都不是單個細胞獨有的，而是相應(yīng)獨立反應(yīng)體系中的所有細胞共享的，但細胞或細胞核在兩輪標簽之間隨機混合，兩種標簽的組合能夠唯一地識別單個細胞。

•  經(jīng)透化處理的細胞或細胞核微孔板里進行反轉(zhuǎn)錄，并加上孔位特異性的第一輪標簽

• 細胞帶著加標簽的cDNA進行10x上機，每個油包水里有1個Gel bead和多個細胞

• 細胞在油包水中裂解

• cDNA通過等溫連接加上第二輪即Gel bead上的10x barcode標簽

• 通過識別兩輪標簽組合拆分單細胞數(shù)據(jù)

       scifi 方法在概念上不同于cell hashing，cell hashing標簽區(qū)別的是各個樣品，而scifi基于全轉(zhuǎn)錄組預(yù)索引標簽，可以將轉(zhuǎn)錄本從超量上樣的油包水中溯源為各自的單細胞轉(zhuǎn)錄組。另外，scifi在可操作性上優(yōu)于傳統(tǒng)的多輪組合標簽的方法，多輪組合標簽實驗流程繁瑣，且每個細胞的轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性較低。Scifi將微孔板和微流控組合，在 Chromium Controller系統(tǒng)的每個通道可獲得多達 150,000個單細胞轉(zhuǎn)錄組，每張芯片100 萬個單細胞轉(zhuǎn)錄組，且每個細胞能夠獲得高復(fù)雜性的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。作者用多種細胞系以及原代細胞進行了方法學驗證。作者推測scifi-RNA-seq 最可能立即用于兩個領(lǐng)域：追求復(fù)雜組織、器官或整個生物體的單細胞表征的細胞圖譜項目，以及高通量擾動研究，包括藥物篩選和單細胞 CRISPR 篩選。

滴~EMTD溫馨提示

       目前此方法仍處于學術(shù)研究、實驗室研發(fā)范疇，未達到經(jīng)反復(fù)檢驗的商業(yè)化應(yīng)用階段。10x 目前已推出超高通量的Chromium X及試劑 ，結(jié)合CellPlex 試劑盒，單張芯片通量可達到百萬細胞級別。
 

玩轉(zhuǎn)10x之二：
ASAP-seq, Dogma-seq單細胞DNA/RNA/Protein
中心法則三要素一網(wǎng)打盡

       美國紐約基因組中心的研究人員開發(fā)了兩種單細胞多組學檢測方法，一種是借助10x scATAC試劑盒，在單細胞水平同時檢測染色質(zhì)可及性、蛋白水平和線粒體DNA，命名為ASAP-seq (ATAC with select antigen profiling)。在文章的審稿過程中，10x推出了GEX+ATAC的單細胞多組學試劑盒，作者在此基礎(chǔ)上又開發(fā)了一種新方法Dogma-seq，實現(xiàn)單細胞同時檢測染色質(zhì)可及性、mRNA表達、蛋白水平和線粒體DNA克隆追蹤四重信息。這一成果發(fā)表在6月3日出版的Nature Biotechnology上。
       常規(guī)做ATAC-seq通常要盡量減少線粒體DNA的干擾，但作者認為如果能夠富集獲得高覆蓋度的線粒體信息，就可以通過線粒體基因組攜帶的突變進行追蹤，以研究細胞間的相互關(guān)系。作者又基于CITE-seq技術(shù)還開發(fā)了一套bridge oligos，使得帶oligo標簽的抗體檢測可以整合到ATAC-seq的流程中。

       上圖詳解了ASAP-seq如何將蛋白檢測整合進scATAC-seq的工作流程。a.細胞樣品前處理用連有oligo的抗體染色，而后對細胞進行固定、透化處理、Tn5酶專座。b.在油包水微滴內(nèi)，抗體標簽結(jié)合外加的bridge oligos并以其為模板延伸，延伸后可以同Gel beads上的oligo互補，后續(xù)抗體標簽和ATAC酶切下來的DNA片段均被加上細胞Barcode。
      作者進一步將蛋白檢測推進到細胞內(nèi)蛋白水平，ASAP-seq的細胞固定后透化處理步驟有可能用于檢測胞內(nèi)蛋白，而這在高通量的scRNA-seq中是無法做到的。作者用不同接頭的抗體標簽以區(qū)別胞內(nèi)和細胞表面蛋白，用細胞表面蛋白TSA TBNK panel和3種TSB胞內(nèi)蛋白抗體染色PBMC，在根據(jù)單細胞ATACT結(jié)果分群的圖中，蛋白marker的分布與先驗知識以及基因活性值是一致的。

       上圖展示了ASAP-seq檢測細胞表面及胞內(nèi)蛋白的實驗設(shè)計和結(jié)果。a.PBMC先染細胞表面的TSA TBNK Panel，進行細胞固定和透化，而后染TSB胞內(nèi)的蛋白。b.PBMC根據(jù)ATAC結(jié)果分群，將主要的外周血細胞類型進行了注釋。c和d分別顯示了細胞表面和胞內(nèi)蛋白細胞分布。         Dogma-seq借助10x的多組學試劑，蛋白檢測應(yīng)用帶Poly A的Total-seq A抗體標簽，可以和多組學Gel bead上的oligo T互補。作者測試了LLL和DIG不同的細胞透化方法，LLL是指使用0.1% PFA / 0.1% NP40，DIG方法為使用0.01% Digitonin，結(jié)果顯示LLL可得到更多更完整的線粒體DNA信息用于追蹤，而DIG方法可以更好地檢測細胞表面蛋白。