流式細(xì)胞術(shù)的基本原理和常見應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：7434　發(fā)布日期：2021-7-8　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）從字面意義理解，F(xiàn)low——Fluid、Cyto——Cell、Metry——Measurement，流式細(xì)胞術(shù)指的就是檢測(cè)流動(dòng)細(xì)胞的一種技術(shù)，能在細(xì)胞流動(dòng)的狀態(tài)下，快速檢測(cè)細(xì)胞或顆粒物的特異性指標(biāo)。它是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。

基本原理
流式細(xì)胞術(shù)用到的儀器叫流式細(xì)胞儀（Flow cytometer ），是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來。目前廣泛應(yīng)用于外周血細(xì)胞的免疫表型分析、凋亡分析和細(xì)胞因子的檢測(cè)。

在一定的壓力下，鞘液帶著細(xì)胞或者微粒通過噴嘴中心進(jìn)入到流式照射室，在流式照射室的分析點(diǎn)，激光照射細(xì)胞并發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光，同時(shí)被熒光標(biāo)記的顆粒發(fā)射出熒光。散射光和熒光分別被不同的檢測(cè)器接收，通過光電倍增管將檢測(cè)到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，這些電信號(hào)放大后再經(jīng)過數(shù)據(jù)化處理輸入電腦，供我們進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞儀工作原理

流式通道
流式通道主要可以分為散射光通道和熒光通道。
流式細(xì)胞儀中能測(cè)定兩種方向的散射光信號(hào)，即FSC（前向角散射）和SSC（側(cè)向角散射）。
FSC的值代表細(xì)胞的大小：細(xì)胞體積越大，其FSC值就越大。所以可以利用細(xì)胞的FSC值初步比較細(xì)胞的大小，利用FSC值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群和分類。
SSC的值代表細(xì)胞的顆粒度：細(xì)胞越不規(guī)則，細(xì)胞表面的突起越多，細(xì)胞內(nèi)能夠引起激光散射的細(xì)胞器或者顆粒性物質(zhì)越多，其SSC值就越大。所以可以利用細(xì)胞的SSC值初步比較細(xì)胞的顆粒度，利用SSC值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群和分類。
因此，根據(jù)不同的 FS 和 SS 可將這些細(xì)胞分成不同的細(xì)胞群。樣品細(xì)胞不需要標(biāo)記任何熒光素偶聯(lián)抗體，直接上樣分析就可以得到樣品細(xì)胞的FSC值和SSC值，其值代表的是細(xì)胞的大小和顆粒度這兩個(gè)基本的物理特征，所以樣品的FSC-SSC散點(diǎn)圖又稱為樣品細(xì)胞的 “物理圖”。
熒光通道表示的不是細(xì)胞特有的物理特征，而是其化學(xué)特征。與根據(jù) FS 和 SS 區(qū)分細(xì)胞群類似，可根據(jù)是否表達(dá)特定蛋白區(qū)分細(xì)胞。這種情況下，通常使用熒光染料對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色。用于檢測(cè)目標(biāo)蛋白的熒光染料被相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)的激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射熒光。這些被熒光染色的細(xì)胞或顆粒會(huì)被單獨(dú)檢測(cè)。熒光通道接收到的信號(hào)越強(qiáng)，表示細(xì)胞上結(jié)合的熒光素越多，那么細(xì)胞表面表達(dá)的該CD分子就越多，因此可根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱判斷細(xì)胞表達(dá)該CD分子的相對(duì)數(shù)量。

常見流式圖

-流式直方圖-

流式直方圖本質(zhì)上就是統(tǒng)計(jì)直方圖，是累積顯示細(xì)胞量非常大而統(tǒng)計(jì)區(qū)間又非常小的統(tǒng)計(jì)直方圖。橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)；一般是相對(duì)細(xì)胞數(shù)。

-流式散點(diǎn)圖-

散點(diǎn)圖十分利于兩參數(shù)圖，而兩個(gè)參數(shù)分別分布在x軸和y軸上，并且細(xì)胞計(jì)數(shù)以密度（點(diǎn)）圖或輪廓圖的形式顯示，可顯示其頻率分布，同時(shí)也可以不同的顏色以標(biāo)識(shí)給定位置的單元格密度。當(dāng)用象限標(biāo)記將散點(diǎn)圖分為四個(gè)部分時(shí)，在直方圖理解的基礎(chǔ)上，可知右上象限表示熒光標(biāo)記均為陽(yáng)性或雙陽(yáng)性細(xì)胞，而左下象限則恰恰是顯示兩個(gè)標(biāo)記均為負(fù)的細(xì)胞，左上象限和右下象限則分別代表只對(duì)y軸參數(shù)或x軸參數(shù)標(biāo)記為正的細(xì)胞。

-等高線圖-

流式等高線圖的意義和實(shí)際應(yīng)用與流式散點(diǎn)圖較為相似，可以看作是流式散點(diǎn)圖的一個(gè)變體。相比之下，流式散點(diǎn)圖更為直觀，所以應(yīng)用也更為廣泛。當(dāng)然，流式等高線圖也有其自身的優(yōu)點(diǎn)，它較能直觀地體現(xiàn)細(xì)胞群的集中點(diǎn)，等密度環(huán)線的中央?yún)^(qū)域代表一個(gè)細(xì)胞群的集中點(diǎn)，一般代表一個(gè)細(xì)胞群，所以在某些情況下，流式等高線圖比流式散點(diǎn)圖更能直觀地體現(xiàn)細(xì)胞的分群。

應(yīng)用
一、流式細(xì)胞術(shù)可以用來檢測(cè)細(xì)胞表面以及胞內(nèi)的各種標(biāo)志，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群鑒定以及各種蛋白表達(dá)量高低的比較。不僅僅是免疫細(xì)胞，其他的如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞等都可以用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析和分選。
二、通過標(biāo)記Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相關(guān)基因，流式細(xì)胞術(shù)可用來檢測(cè)細(xì)胞的增殖以及凋亡。
三、流式細(xì)胞術(shù)可用來分析細(xì)胞周期。細(xì)胞核DNA含量隨著細(xì)胞增殖周期時(shí)相的不同而發(fā)生變化，用DNA染料進(jìn)行染色，DNA含量多，熒光信號(hào)強(qiáng)，DNA含量少，熒光強(qiáng)度低。在腫瘤學(xué)研究中尤其常用，可以用于判斷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞影響、腫瘤的生長(zhǎng)速度等。
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