利用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

新生兒臍帶

醫(yī)用手術(shù)器械，生物安全柜，CO₂培養(yǎng)箱，6孔培養(yǎng)板，T25培養(yǎng)瓶

實(shí)驗(yàn)試劑

表.  MSC NutriStem^®XF Medium

1. 凍存的MSC NutriStem^® XF Supplement在室溫或2-8℃解凍，避免反復(fù)凍融。

2. 配制：MSC NutriStem^® XF Basal Medium（培養(yǎng)基）：MSC NutriStem^® XF Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周內(nèi)使用。

注1：雙抗非必須，建議原代（P0）時(shí)使用。

注2：培養(yǎng)基含L-Glutamine，貯藏時(shí)避免長期照光。

或跳過此步驟，直接加2%血小板裂解物，促進(jìn)MSC細(xì)胞貼壁與生長。

如果使用05-752-1H，參考如下步驟：

1. 使用DPBS溶液（BI，Cat：02-023-1A），將MSC貼壁試劑稀釋100倍（1:100）。

2. 參照下表，加入適量的1X MSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。

表. 涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-752-1）

注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)試后可減半使用。）

3. 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。

4. 在2-8℃孵育過夜；或者在CO₂培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育30分鐘。

5. 接種前, 吸除貼壁試劑，再用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。

1. 使用生理鹽水，將NutriCoat™ 促貼壁試劑稀釋500倍（1:500）。

2. 參照下表，加入適量的1X NutriCoat™ 促貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。

表.  涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-760-1-15）

注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。

注2：包被期間，注意包被液不可以干掉！

3. 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。

4. 在2-8℃孵育過夜；或者在CO₂培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育1小時(shí)。

5. 接種前, 吸除貼壁試劑，用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿（或不需要清洗），即可接種細(xì)胞。

使用無菌的DPBS，將50X大豆胰酶抑制劑（BI，Cat：03-048-1C）稀釋成1X。

注1：抑制重組胰酶消化建議方法：

第一種使用大豆胰酶抑制劑；

第二種使用PBS/DPBS清洗（2倍重組胰酶量）吹打, 離心去上清；第三種使用維持培養(yǎng)基抑制。

無血清培養(yǎng)基抑制胰酶效果較差，使用無血清培養(yǎng)基時(shí)建議用第一或者第二種方法抑制/清除胰酶。

1. 無菌條件下取新鮮臍帶，用DPBS漂洗凈血跡。

注1：一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用75%酒精潤洗。

2. 置10 cm于培養(yǎng)皿中，剪成1~2cm臍段，剔除血管，用DPBS洗凈血跡，再剪成1 mm³組織塊。(圖1)

3. 用無菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個(gè)孔中。

4. 37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱孵育30min，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上。

5. 向每孔滴加0.8 ml 完全培養(yǎng)基（注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動(dòng)組織塊） 。

6. 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱孵育過夜，次日（D1）每孔再補(bǔ)加1 ml 完全培養(yǎng)基。

7. 37℃，5% CO₂ 繼續(xù)培養(yǎng)，5天（D6）后半量換液（此時(shí)一般看不到細(xì)胞，但最快3天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出）。

8. 再過5天后半量換液（此時(shí)一般會(huì)有細(xì)胞爬出，但最晚可到14天會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出）(圖2、圖3)。

9. 每2天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2~4天，待細(xì)胞融度（Confluency）達(dá)到約80%后傳代培養(yǎng)（圖4）。

注1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動(dòng)作要盡可能輕微，避免沖動(dòng)組織塊。培養(yǎng)基加量不能太多，以免組織塊漂浮。

圖1. 剔除臍帶3根動(dòng)靜脈血管

圖2. 細(xì)胞從組織塊邊沿爬出

圖3. 細(xì)胞快速增殖

​​​​​​​圖4. 傳代時(shí)機(jī)成熟

UC-MSC原代培養(yǎng) （消化法）

MSC NutriStem^®無血清培養(yǎng)基能有效地培養(yǎng)消化法獲得原代細(xì)胞，操做方式參考如下：

1. 將臍帶用DPBS（BI，Cat：02-023-1A）+1%青鏈雙抗（BI，Cat：03-031-1B）漂洗3~5次，剪成 1-2 cm大小，剔除兩根動(dòng)脈血管和一根靜脈血管，獲得華通氏膠，同時(shí)稱重。

2. 將組織塊剪成 3-5 mm³，移入50 ml 離心管，再加入相應(yīng)比例的分離液（VC，Cat：C3501-0100）。

3. 組織塊（華通氏膠g）: （分離液vol）= 1:3（1g:3ml），在分離液中添加1%青鏈雙抗。

4. 把 50 ml 離心管橫放于 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，靜置16小時(shí)。（若使用旋轉(zhuǎn)法，則置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)4 h，轉(zhuǎn)速為10 rpm。）

5. 消化反應(yīng)結(jié)束之前，預(yù)先在6孔板中加入1ml完全培養(yǎng)基（NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold），置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)，達(dá)到預(yù)包被的效果。

注1：推薦使用MSC Attachment Solution（BI，Cat：05-752-1F）包被，效果更好。

6. 加入和分離液等體積的0.05%EDTA （BI，Cat：03-015-1B）終止反應(yīng)后，將樣品轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1200xg 離心5分鐘，離心時(shí)調(diào)至最慢降速（有剎車），去除上清，溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細(xì)胞；建議留下 2 ml 左右的溶液。

7. 以和分離液等體積的DPBS+1%青鏈雙抗重懸細(xì)胞后，500 xg 離心 5 分鐘，離心時(shí)調(diào)至最慢降速（有剎車），小心去除上清，不要影響下層的細(xì)胞；建議留下 1.5 ml左右的溶液。重復(fù)本步驟操作3次。

8. 用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后（重懸后細(xì)胞懸液總體積為3 ml），計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種原代細(xì)胞培養(yǎng)。（原代細(xì)胞推薦用NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold培養(yǎng)）

注：消化后的原代細(xì)胞，建議培養(yǎng)時(shí)接種密度提高10000/cm²以上；傳代后即可按常規(guī)的接種密度（5000~6000/cm²）培養(yǎng)。

UC-MSC傳代培養(yǎng)與凍存

1. 待細(xì)胞融和度達(dá)到約80%后進(jìn)行傳代（細(xì)胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基，每孔加適量DPBS輕輕沖洗1次。

2. 根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重組胰酶-EDTA（BI，Cat：03-079-1A，T25建議使用1 ml），在37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱作用3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）。

3. 顯微鏡下觀察細(xì)胞完全脫落后，使用5-10 ml稀釋大豆胰酶抑制劑（SBTI，BI，Cat：03-048-1，1X），1000 rpm離心3~5 min。

4. 謹(jǐn)慎吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊用適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液。

5. 按照所需的比例進(jìn)行傳代或按照5000-6000cells/cm²的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中，放入37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

6. 每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，參照上述操作步驟1~5做細(xì)胞傳代；或者參照操作步驟1~3收獲細(xì)胞凍存。

7. 細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于適量NutriFreez® D10無血清凍存液（Cat：05-713-1）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置30 min，-80℃冰箱放置 24 h，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。

注1：本方法僅供參考，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)做合理調(diào)整。

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