常用外泌體研究樣本來源有哪些？

Chris Gardiner等2016發(fā)表的調(diào)查報(bào)告有報(bào)道細(xì)胞培養(yǎng)上清液是最常用來提取外泌體的樣本來源，除了細(xì)胞上清，其他最常見的體液是血漿(47%)、血清(22%)、尿液(14%)、腦脊液(8%)和乳汁(5%)。

(Gardiner C et al., 2016, J Extracell Vesicles)

逍鵬生物Dr.Cell實(shí)驗(yàn)室從外泌體NTA檢測(cè)樣本中統(tǒng)計(jì)分析了其中1620例，對(duì)其外泌體來源進(jìn)行分析，結(jié)果如下圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明外泌體來源趨勢(shì)與以上文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。NTA檢測(cè)樣本的外泌體最常用來源依次是細(xì)胞培養(yǎng)液、血清、血漿、組織、尿液等。
 

我們預(yù)計(jì)當(dāng)外泌體更多的應(yīng)用于診斷與預(yù)后評(píng)估時(shí)，血清與血漿樣本比例應(yīng)會(huì)大幅
持續(xù)上升。
 

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如何鑒定提取出來的外泌體？

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，也沒有任何一個(gè)單一實(shí)驗(yàn)可以確定外泌體的存在。根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)發(fā)表的指導(dǎo)手冊(cè)《MISEV 2018》，外泌體特征鑒定通過NTA測(cè)粒徑分布、TEM電鏡分析形態(tài)、WB檢測(cè)標(biāo)志蛋白三項(xiàng)來驗(yàn)證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度，TEM電子顯微鏡來觀察樣品中外泌體的形態(tài)特征，WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白。

 

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外泌體如何保存？

不同時(shí)間、溫度的保存對(duì)不同的外泌體樣本影響不一；如果研究方向?yàn)橥饷隗w形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析，在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存。

短時(shí)間幾天內(nèi)可以放4°C，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存置于-80°C保存。

 

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NTA檢測(cè)可以進(jìn)行外泌體定量嗎？

NTA是物理方法，基于顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，因?yàn)椴还苁侵�質(zhì)體、蛋白，甚至是PBS中的顆粒（部分實(shí)驗(yàn)室自行配置的PBS中發(fā)現(xiàn)大量顆粒，推薦在外泌體研究中，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500），避免干擾），都會(huì)被軟件讀取，并不能分辨是否為外泌體。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內(nèi)含物是否在外泌體的粒徑范圍內(nèi)；另外，在做外泌體分泌的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數(shù)據(jù)。

 

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外泌體NTA檢測(cè)需要多少量？

Zetaview儀器的最佳檢測(cè)區(qū)間是10^7 particles/ml，且有濃度檢測(cè)下限，為10^5 particles/ml，一般進(jìn)樣量不少于2 ml；

無法準(zhǔn)確建議送樣量，檢測(cè)需要量與樣本本身濃度有關(guān)，樣本濃，則用量小，反之則多，根據(jù)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl時(shí)大多由于樣本分泌量過低、提取失敗或者對(duì)樣本有過多稀釋。

一般建議：送樣量不低于30 µl。

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外泌體用什么分離方法比較好？

無法明確哪種分離方法比較好，各有千秋，以下列出常用的外泌體分離方法：

• 超速離心法（差速離心和密度梯度離心）：操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，分離外泌體純度較高，但得率低，目前分離外泌體主流方法；

• 尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）：應(yīng)用填充多孔聚合物微球的柱子，精確分離大小分子，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，分離外泌體純度較高；

• 聚合物沉淀法：操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，可能會(huì)同時(shí)分離非囊泡污染物（包括脂蛋白），分離外泌體純度較低；

• 磁珠免疫法：通過特定的抗體組合從樣本中捕獲不同類型的外泌體，免疫親和技術(shù)具有高特異性、可獲得高純度的外泌體、且不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，是富集表征獨(dú)特的外泌體的優(yōu)選方法。但是此方法效率低，外泌體內(nèi)含物的生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

• 組合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌體純化試劑盒）純化流程溫和，無需高速離心，操作簡(jiǎn)便并且產(chǎn)物純度高，分離出的外泌體完好無缺，適用于下游功能研究、WB驗(yàn)證、RNA分析等。

 

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WB檢測(cè)哪個(gè)蛋白指標(biāo)？

外泌體相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，排在前4位的檢測(cè)指標(biāo)為CD63、TSG101、CD9、CD81；接著檢測(cè)較多的4個(gè)指標(biāo)為Alix、HSP70、flotillin和Syntenin等。
然《MISEV 2018》并未提出可以特異性地表征外泌體的分子標(biāo)記。僅列出了必須在所有外囊泡制劑中分析的三類標(biāo)記物，以證明外囊泡（類別1和2）并評(píng)估其從常見污染物中的純度（類別3）。
注：
類別1：跨膜或GPI錨定蛋白，質(zhì)膜和/或胞內(nèi)體上任何類型外囊泡的標(biāo)志，如CD63、CD81、CD82、CD9等；
類別2：細(xì)胞溶質(zhì)蛋白（cytosolic proteins ，真核細(xì)胞和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌）或周質(zhì)蛋白（periplasmicproteins，革蘭氏陰性細(xì)菌），分析確定脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，如TSG101、HSP70、ALIX等；

類別3：非外囊泡結(jié)構(gòu)的主要成分，通常與外囊泡共同分離。主要用來評(píng)估外囊泡制劑的純度，如血清、血漿中的脂蛋白。

即《MISEV 2018》要求外泌體標(biāo)志物鑒定，至少2個(gè)陽(yáng)性指標(biāo)：CD9、CD63、CD81 三選一以及TSG101、HSP70、ALIX三選一，另外純度鑒定再加陰性對(duì)照。

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WB檢測(cè)用什么內(nèi)參基因？

目前大部分文獻(xiàn)中沒有檢測(cè)內(nèi)參基因，個(gè)別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行檢測(cè)，從文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果來看，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達(dá)豐度相對(duì)于正常細(xì)胞樣品中的較低，Western blot檢測(cè)時(shí)可能會(huì)檢測(cè)不到任何條帶或者條帶微弱。因此，更多的是用等蛋白定量校準(zhǔn)樣品間的差異。

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WB檢測(cè)需不需要裂解？

裂解和不裂解都可以，建議裂解，裂解后蛋白濃度會(huì)更高。

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外泌體電鏡是不是一定要有膜結(jié)構(gòu)？

負(fù)染電鏡結(jié)果中外泌體的形態(tài)是那種明顯的茶托樣，邊緣有一圈略微更明亮的亮圈。如果結(jié)構(gòu)是沒有膜結(jié)構(gòu)的圓球形，很可能是脂蛋白顆粒或者抱團(tuán)的蛋白質(zhì)。

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 外泌體研究中細(xì)胞培養(yǎng)用無血清還是血清培養(yǎng)？

外泌體研究中，如果仍然使用胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞、通過收集上清液來提取外泌體，胎牛血清中大量的牛源外泌體將對(duì)實(shí)驗(yàn)分析造成極大的干擾。建議使用去外泌體血清（P/N:C3801-0050）培養(yǎng)細(xì)胞。