導(dǎo)讀：自從抗體被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，有多種方法可用于分離純化抗體，全球的科學(xué)家們一直在探索高效的單抗分離純化方法，以及適于抗體藥物規(guī)模生產(chǎn)的工藝。

制備高特異性、高效價(jià)的抗體是實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)技術(shù)及抗體藥物療效的基礎(chǔ)，未純化或純化不好的抗體，不僅會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，而且還可能產(chǎn)生與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相悖的結(jié)論，抗體試劑質(zhì)量的高低將直接影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性甚至實(shí)驗(yàn)的成敗。

為了獲得成分相對(duì)單一的抗體或?qū)⒖贵w用于特定的用途，就需要進(jìn)行抗體純化，這樣一方面可以顯著降低非特異性本底，去除易引起實(shí)驗(yàn)誤差的污染蛋白或雜質(zhì)；另一方面，也能精確控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的抗體量及提高檢測(cè)試劑的靈敏度及準(zhǔn)確性。在多種不同的技術(shù)中,親和層析是純化抗體最具選擇性、快速和容易的純化方法。對(duì)于IgG的純化，通常情況下，我們都會(huì)選擇使用Protein A或Protein G進(jìn)行親和層析。

提到Protein A和Protein G，相信大家并不陌生，由于它們和抗體的特異性親和作用，可用于純化抗體，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等，其應(yīng)用非常廣泛。為了更好的區(qū)分與選擇Protein A和G，小編在此，將對(duì)這兩類填料的“來(lái)世今生”一一進(jìn)行介紹。

Protein A層析：
天然的Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，分子量42kD，它能夠特異性地結(jié)合多種免疫球蛋白的Fc區(qū)，而與Fab區(qū)結(jié)合很弱，具有5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(A,B,C,D,E,見(jiàn)下圖)和未知功能的非Fc結(jié)合域（X,見(jiàn)下圖），此結(jié)構(gòu)的蛋白A在大量結(jié)合IgG的同時(shí)，由于其非Fc結(jié)合域結(jié)合部分雜蛋白，導(dǎo)致洗脫下來(lái)的IgG純度不夠。天然的Protein A結(jié)構(gòu)示意圖如下：
 

                                                  圖1：天然的Protein A結(jié)構(gòu)示意圖

對(duì)此，科學(xué)家利用基因工程的方法對(duì)Protein A基因進(jìn)行改造，將蛋白A的Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域（即IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行保留，對(duì)其非Fc結(jié)合域截短，分子量變小為35kD，其非特異性結(jié)合明顯降低，也消除了對(duì)Fab段的親和作用。同時(shí)末端經(jīng)過(guò)改造后加上一個(gè)C端的半胱氨酸，利用環(huán)氧活化的方式單點(diǎn)偶聯(lián)到瓊脂糖上，在降低空間位阻的同時(shí)也提高IgG的結(jié)合能力。

但是無(wú)論天然蛋白A還是重組蛋白A依然存在對(duì)NaOH高度敏感，在強(qiáng)堿性條件下易變性或脫落，因此運(yùn)用時(shí)只能選用高濃度的鹽酸胍或尿素進(jìn)行清洗，但清洗的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如NaOH，導(dǎo)致清洗成本非常高。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在重組蛋白A的5個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，B位點(diǎn)的結(jié)合IgG能力最強(qiáng)，通過(guò)將B位點(diǎn)對(duì)堿敏感的Asp 氨基酸突變?yōu)槟蛪A的氨基酸，其耐堿性大大提高，然后對(duì)該區(qū)段進(jìn)行復(fù)制，得到新的四聚體配基SuRe Ligand，其載量更高，避免了Protein A中不同IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗體Fc段親和性的差異，使得洗脫條件更加均一而溫和。相比以rProtein A 為配基的介質(zhì)，Mabselect SuRe介質(zhì)可以用更高的pH進(jìn)行洗脫，可有效避免抗體在低pH下的聚集，純化的產(chǎn)品純度和均一性更高，濁度也更低。
 

                              圖2：天然蛋白A、重組蛋白A及SuRe的基因改造位點(diǎn)及相互關(guān)系圖

近年來(lái)，Cytiva又重磅推出的全新概念纖維基質(zhì)親和層析產(chǎn)品HiTrap Fibro PrismA 和 HiScreen Fibro PrismA。此系列產(chǎn)品顛覆了傳統(tǒng)瓊脂糖骨架的純化模式，利用了纖維束高流速和高通量的特點(diǎn)，通過(guò)Fibro 全新基架+PrismA 配基強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，極大縮短了蛋白的保留時(shí)間，使得一次抗體純化在5分鐘內(nèi)輕松搞定。在具有高載量高通量的同時(shí)，此層析介質(zhì)能夠耐受 2M NaOH，確保能夠?qū)崿F(xiàn)更高效的清潔和滅菌�？蓪⒄麄�(gè)工藝生產(chǎn)周期縮短在一天之內(nèi)完成。生產(chǎn)能力相較于傳統(tǒng)填料能提高 20 倍以上。

綜上所述，由于Protein A耐堿形式的突變體，具有高選擇性和穩(wěn)定性，脫落更少。因此，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)工藝中，大家都會(huì)選擇protein A親和層析作為抗體純化的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)步驟。作為層析純化的第一步，從澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲抗體，通過(guò)此步，IgG樣品純度一次純化可超過(guò)90%，并且適用于所有人源的(非IgG3)抗體和Fc融合蛋白的純化。
 

Protein G層析：

Protein G是從G類鏈球菌（Streptococci）中分離出來(lái)的胞壁蛋白，分子量25kDa，相對(duì)于Protein A，Protein G對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG有著更高的親和力。

由于天然Protein G不僅與免疫球蛋白的恒定區(qū)相結(jié)合,且與白蛋白、α2-巨球蛋白相結(jié)合,這使得用天然Protein G親和色譜提純抗體時(shí),無(wú)法去除體系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前這一問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)基因修飾的方法表達(dá)Protein G得以解決，重組蛋白G已經(jīng)去除了白蛋白結(jié)合位點(diǎn)（血清白蛋白是抗體來(lái)源的主要污染物）及細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)，減少了非特異性結(jié)合。

對(duì)于抗體的Fc段，Protein G與Protein A均可結(jié)合，不同的是Protein G還能結(jié)合Fab段，因此，Protein G可以結(jié)合更多類型的IgG分子及多克隆IgG分子，尤其是對(duì)人IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。因此，Protein G可用于純化不能與Protein A很好結(jié)合的哺乳動(dòng)物單抗和多抗IgG。但由于protein G的填料要比protein A的貴不少，且載量比較低，洗脫的時(shí)候protein G的pH要比protein A更低一些，因此，目前多數(shù)情況下只是作為Protein A備選填料使用。
 

                                 圖3：Protein G與Protein A結(jié)合位點(diǎn)的簡(jiǎn)單圖示

北京同立海源生物科技有限公司，真核表達(dá)GMP級(jí)免疫治療上游原料生產(chǎn)企業(yè)�？谷藛慰寺】贵w產(chǎn)品線，真核表達(dá)翻譯后修飾與天然抗體類似性高、活性強(qiáng)、效果好、穩(wěn)定性高。同時(shí)，我司可按需要對(duì)抗體的相關(guān)基因進(jìn)行突變或重組改造。