如何用正確的方法進行細胞計數？

很多小伙伴們在細胞培養(yǎng)過程中會有這樣的疑問，“我計數的細胞數量準確嗎？”今天我們就來聊一聊如何進行細胞計數。

在進行細胞計數之前，我們先來了解一下血細胞計數板的構造。
 

血細胞計數板的構造

血細胞計數板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有4條下凹的槽，槽與槽之間構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半靠近橫槽一邊上面刻有一個方格網。方格網上刻有9個大方格（見圖1C），其中只有中間的一個大方格為計數室，供細胞計數用。計數室通常有兩種規(guī)格：一種是大方格內分為25個中方格（中方格之間用雙線分開，見圖1D），每一中方格又分為16 個小方格；另一種是大方格內分為16個中方格，每一中方格又分為25個小方格。不管計數室是哪一種構造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16×25=400個小方格組成（見圖1D）。

圖1. 血細胞計數板的構造

注：計數室邊長為1 mm，面積為1 mm² ，每個小方格的面積為1/400 mm²。蓋上蓋玻片后，計數室的高度為0.1 mm，所以其體積為0.1 mm³ ，每個小方格的體積為1/4000 mm³。
 

01實驗材料

無 菌：DPBS、0.25%胰蛋白酶、吸管、完全培養(yǎng)基。

非無菌：移液器、20 μl或100 μl 可調式、血細胞計數板、95%乙醇溶液或無水乙醇、0.4% 臺盼藍溶液（BI貨號：03-102-1B）、數字計數器、普通顯微鏡。

 

02實驗原理

在細胞培養(yǎng)工作中，常需要了解細胞生活狀態(tài)和鑒別細胞是否存活，確定細胞接種濃度和數量以及了解細胞活力和增殖狀況，如胰酶消化制備的細胞懸液中細胞存活率確定，凍存細胞復蘇后的活力檢測等。

存活測試的原理為染料排除實驗，利用染料會滲入死細胞中而呈色，因活細胞細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用臺盼藍染料，如果細胞不易吸收臺盼藍，則用赤蘚紅B。計算細胞活率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。計數應在臺盼藍染色后數分鐘內完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料；因為臺盼藍與蛋白質有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數更為準確。

 

03實驗內容與方法

1. 制備動物細胞懸液

細胞懸液制備方法是用DPBS液洗滌、0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培養(yǎng)基（或Hanks液，PBS或DPBS等平衡鹽溶液），輕輕吹打混勻，制成待測細胞懸液。

2. 細胞計數

• 計數板處理

  在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數。將清潔干凈的血細胞計數板的計數室上加蓋專用蓋玻片。

• 染色

  用滴管吸取0.4%臺盼藍染液（BI貨號：03-102-1B），按1∶1比例加入細胞懸液中，輕輕吹打混勻。將細胞懸液滴于蓋玻片邊緣，使之充滿計數板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計數板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計數。

• 計數方法

  按圖計算計數板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內的細胞數。計數時，只計數完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計上線細胞不計下線細胞，計左線細胞不計右線細胞。兩次重復計數誤差不應超過±5%。鏡下觀察，凡折光性強而不著色者為活細胞，染上藍色者為死細胞。

• 計數換算

  計完數后，需換算出每毫升懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為 0.01 cm²，高為 0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm³，即0.1 mm³=1×10⁴ ml，所以每一大方格內細胞數×10⁴=細胞數/ml，故可按下式計算：細胞懸液細胞數 /mL = （四個大格細胞總數 /4）×2×10⁴。公式中乘以2，是因為細胞懸液于臺盼藍染液是1：1稀釋。如計數前已稀釋，可再乘稀釋倍數。計數細胞后，計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數的比例。

• 示例
  T75 單層培養(yǎng)，制成10 ml細胞懸浮液，取0.1 ml溶液與0.1 ml 臺盼藍混合均勻于離心管中，取少許混合液加入血細胞計數板，計數四大方格內的細胞數目。

• 活細胞數/方格：55，62，56，60；死細胞數/方格：5，3，4，6；細胞總數=251

• 平均細胞數/方格=62.75；稀釋倍數=2；
  細胞數/ml：62.75×10⁴×2（稀釋倍數）=1.26×10⁶；
  細胞數/flask（10 ml）：1.26×10⁶×10 ml=1.26×10⁷

• 存活率：233/251﹦92.8%

注意事項 

• 滴細胞懸液時要干凈利落，加量要適當，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片也會失敗，應重做；過少易出現氣泡；不理想時，應重做。

• 鏡下計數時，若方格中細胞分布明顯不均勻，說明細胞懸液混合不均勻，需重新將細胞懸液進行混合，再重新計數。

• 計數時，對于位于邊線或交界處的細胞/細胞團，遵循“計上不計下，計左不計右”的規(guī)則。

• 一個細胞團計做一個細胞。

• 計數板計數時，最適濃度為5～10×10⁵細胞/ml，此范圍外計數誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數。如果細胞數目很少則要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

圖2. 細胞計數示意圖（圖源網絡）

 

血細胞計數板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗刷后自行晾干或者用吹風機吹干，或用95%乙醇，無水乙醇等有機溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復清洗，直到干凈為止。

 

1. 人工失誤（混勻、加樣、稀釋、計算錯誤以及人工操作誤差）。

2. 多次計數以保證結果準確的必要性。

3. 細胞均勻分布的要求。

4. 儀器及材料差異（柵格，深度，蓋玻片，緩沖液類型以及移液器）。

血細胞計數板幾百年來在生物醫(yī)學研究中一直都是一個必備的工具，并且經歷了很多的改進才形成了今天研究者們使用的樣子，但還是會有很多不可避免的計數誤差。

如今，現代化自動細胞計數儀的使用已經很大程度上消除了許多引起誤差的情況，提高了細胞計數的準確性和效率。

目前，市面上也有多種品牌的自動細胞計數儀，有基于細胞圖像的，也有基于Coulter原理的，但是主要目的就是將實驗人員從繁冗無聊的手工計數中解放出來，排除操作者的主觀性。

 

如何選擇推薦細胞計數儀

1. 要考慮細胞計數儀的性價比：如果您的目的只是代替手工計數，節(jié)省操作者的時間，操作簡便，則完全沒有必要花費較多的經費買一臺僅能進行細胞計數的儀器，花大錢辦小事。

2. 要考慮細胞計數儀的穩(wěn)定性和重復性：如果您對細胞計數的準確性和重復性要求高，那儀器的高性能和穩(wěn)定性是首要考慮因素，還要考慮儀器的硬件以及配套軟件的穩(wěn)定性，不能一味的追求低價格。

3. 要考慮根據細胞類型選擇適合的型號：如果您的樣本是原代細胞，背景復雜，紅細胞和血小板污染嚴重，您又希望快速精確計數有核細胞且進行精確細胞活力分析，計數結果的準確性直接影響后續(xù)實驗的成功和重現性。那么雙熒光細胞計數&活力分析儀將是幫您解決問題的有力裝備。

4. 要考慮實驗室多功能檢測需求：如果細胞計數和活力分析只是實驗室的部分需求，而實驗室還要進行凋亡、細胞周期、GFP等功能檢測，且實驗室也無配套的儀器，那為實驗室裝備一款多功能的細胞計數儀是您的最佳之選，省時，省力可以輕松、簡單、隨時親自操作獲得理想結果。

大家可以根據自己的實際情況進行比對選購哦！

References

1. 沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學實驗[M]. 第3版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 90～92.

2. 李洪臣, 楊秀艷. 使用血細胞計數板測定微生物數量實驗的改進[ J ]. 生物學通報, 2007, 42 (7) : 22.