訂書(shū)肽合成技術(shù)

1. 訂書(shū)肽發(fā)展簡(jiǎn)介
訂書(shū)肽是基于多肽需形成α-螺旋通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的需求上發(fā)展起來(lái)的。生物體內(nèi)的多種生命進(jìn)程調(diào)節(jié)都是通過(guò)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。例如病毒的自組裝，細(xì)胞的生長(zhǎng)，分裂，分化等過(guò)程。而通常蛋白-蛋白相互作用的界面太大，從而使小分子藥物很難對(duì)其進(jìn)行靶向定位，達(dá)到高效特異性地阻斷這種相互作用，展現(xiàn)良好的治療效果。蛋白類(lèi)藥物因?yàn)楹茈y順利通過(guò)細(xì)胞膜所以也達(dá)不到直接靶向細(xì)胞內(nèi)相互作用的效果，因此，研究者們開(kāi)始尋求一種能夠克服這兩種藥物缺點(diǎn)的既能夠進(jìn)入細(xì)胞膜又能特異性靶向蛋白-蛋白相互作用的新的藥物分子。

研究表明，具有α-螺旋結(jié)構(gòu)和富含正電荷的多肽可以穿過(guò)細(xì)胞膜。因此，人們開(kāi)發(fā)了利用二硫鍵與分子內(nèi)酰胺鍵作為支架的α-螺旋結(jié)構(gòu)，但是，這些支架在生理環(huán)境下均不能穩(wěn)定存在。2000年，Verdine等發(fā)展了一種用碳碳鍵作為支架來(lái)穩(wěn)定多肽α-螺旋結(jié)構(gòu)的方法，由此方法得到的多肽成為訂書(shū)肽(Stapled peptides)。訂書(shū)肽有更高的α-螺旋程度，結(jié)合能力強(qiáng)，能通過(guò)細(xì)胞膜，難被蛋白酶水解，在生物體內(nèi)半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。

2. 訂書(shū)肽合成
訂書(shū)肽合成策略為在固相合成肽鏈過(guò)程中引入兩個(gè)含有α-甲基，α-烯基的非天然氨基酸，然后兩個(gè)非天然氨基酸之間發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)(RCM)環(huán)化構(gòu)成穩(wěn)定α-螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象的全碳支架，從而合成訂書(shū)肽。

1) α-甲基，α-烯基的非天然氨基酸的合成：
通常，在三乙胺的催化下，手性輔基試劑(1R,2S)-2-氨基-1，2-二苯乙醇與2-溴丙酸乙酯發(fā)生親核取代反應(yīng)，并采用(Boc)2O保護(hù)自由胺基；接下來(lái)，在對(duì)甲苯磺酸的催化下，環(huán)狀的含有手性輔基的丙氨酸前體得以高效生產(chǎn)，在堿性催化劑和低溫下，烯基基團(tuán)高效立體選擇性的連接到氨基酸的α-位，最后，在氨基鋰條件下脫去手性輔基，并采用Fmoc保護(hù)α-胺基。
 
2) 訂書(shū)肽的合成：
通常采用Fmoc-固相多肽合成方法制備訂書(shū)肽，兩個(gè)用于構(gòu)象鎖定的α-甲基，α-烯基的非天然氨基酸之間一般間隔兩個(gè)，三個(gè)或者六個(gè)氨基酸，多肽合成完畢后，采用釕作催化劑進(jìn)行烯烴復(fù)分解反應(yīng)(RCM)，如果實(shí)驗(yàn)需要，還可以進(jìn)行生物素(Biotin)，熒光染色等修飾，最后，將目標(biāo)多肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)進(jìn)行純化得到成品。
 
肽谷生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的摸索與積累，對(duì)合成工藝及方法不斷優(yōu)化，已經(jīng)形成了一套完善的訂書(shū)肽合成技術(shù)，肽谷生物的訂書(shū)肽合成技術(shù)，成功率高，質(zhì)量穩(wěn)定。