1.樣品的準(zhǔn)備。
取適量待測定的抑制劑樣品，用Assay Buffer或DMSO等適當(dāng)?shù)娜軇┡渲瞥蛇m宜濃度的溶液，如果有必要可配制成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻却�用�?/SPAN>

2.陽性對照的準(zhǔn)備。
本試劑盒提供的陽性對照抑制劑Ebselen濃度為10mM，配制在DMSO中，可以根據(jù)需要使用與待測抑制劑一樣的溶劑稀釋成所需濃度或濃度梯度。通常Ebselen的IC₅₀約為0.5μM-2μM，使用本試劑盒時Ebselen的抑制效果參考圖2。

3.樣品測定。
a.根據(jù)樣品數(shù)量(含相關(guān)對照)，參考下表配制適量的Assay Reagent。注：由于2019-nCoV M^pro/3CL^pro的甘油含量較高，微量吸取時要注意避免吸頭吸附損失并吹打完全，加入2019-nCoV M^pro/3CL^pro后需要注意充分混勻。

a.參考下表，使用96孔黑板設(shè)置各組別，并按照下表依次加入檢測試劑和樣品。加入待測樣品后，混勻。為獲得更加可靠的檢測結(jié)果，建議每個樣品至少應(yīng)該進(jìn)行2個重復(fù)孔的檢測。

注：樣品溶劑是指配制和稀釋待測抑制劑所用的溶劑。
b.各孔快速加入Substrate 2μl，混勻。注：加入Substrate后反應(yīng)會立即開始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時間差而導(dǎo)致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進(jìn)行。
c.37℃避光孵育5分鐘后信號即趨于穩(wěn)定，可在5-20分鐘內(nèi)使用多功能酶標(biāo)進(jìn)行熒光測定。激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為490nm。當(dāng)熒光讀數(shù)偏低時，也可適當(dāng)延長孵育時間至20-30分鐘。
注：也可在步驟a中將待測樣品加入后37℃孵育10分鐘，再將Substrate加入反應(yīng)體系中。37℃孵育10分鐘再加入Substrate可能會降低抑制劑的IC₅₀。建議通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定未知抑制劑比較適合的孵育時間。

4.計算:
a.計算每個樣品孔和空白對照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU_空白對照、RFU_{100%酶活性對照}、RFU_陽性對照和RFU_樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。
b.計算每個樣品的抑制百分率。計算公式如下：
抑制率(%) = (RFU_{100%酶活性對照} - RFU_樣品) / (RFU_{100%酶活性對照} - RFU_空白對照) × 100%
c.對于檢測發(fā)現(xiàn)有效的抑制劑，通過檢測該抑制劑的劑量效應(yīng)就可以計算出該抑制劑的IC₅₀。使用本試劑盒檢測Ebselen對于2019-nCoV M^pro/3CL^pro的抑制作用的檢測結(jié)果參考圖2，Substrate直接加入反應(yīng)體系中，然后孵育5分鐘進(jìn)行熒光測定，IC₅₀約為0.62μM。

圖2. 新型冠狀病毒(2019-nCoV) M^pro/3CL^pro抑制劑篩選試劑盒(增強(qiáng)型)檢測Ebselen的效果圖。實(shí)際檢測結(jié)果可能會因樣品和檢測條件等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。