1. 從動物組織中提取總DNA
a．取不超過25mg的組織(脾不超過10mg)，剪切成盡可能小的碎片，加入180微升樣品裂解液A。
請勿使用過多的樣品，過多的樣品會導致抽提效果下降。較小的組織碎片會使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可，但固定過的組織請參考后續(xù)的其它步驟進行。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。裂解的時間因組織不同而有所不同，通常可在1-3小時內完成。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對抽提效果無任何負面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補救措施，可以把整個反應體系放大一倍。
c．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml       RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
轉錄活性水平很高的組織例如肝和腎組織，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步驟(步驟1.c)的情況下，會導致最后獲得的總DNA含有小部分RNA。如果殘余的少量RNA對后續(xù)實驗沒有干擾，可以不進行本步實驗操作，直接進入步驟d。
d．最高速劇烈Vortex 15秒。加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后需立即Vortex混勻。加入樣品裂解液B后可能會產生白色沉淀，但大多數(shù)情況在70℃孵育后會溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會干擾后續(xù)實驗。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會形成凝膠狀物，此時需劇烈晃動或Vortex樣品，以盡量破壞凝
膠狀物。
e．加入200微升無水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。加入乙醇后可能產生白色沉淀，屬正常現(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉移到純化柱內。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內�！�6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉移到DNA純化柱內，否則會嚴重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘�！�12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。如果對于獲得較多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復洗脫一次。第二次洗脫可以增加產量10-80%，特別是當?shù)谝淮蜗疵撓聛淼腄NA大于10微克時，第二次洗脫可以獲得第一次洗脫時50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對洗脫效果的改善相對不太明顯。

2. 從鼠尾中抽提總DNA
a．取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多兩段，加入180微升樣品裂解液A。
小鼠尾尖最長不能超過1.2cm，大鼠尾尖不能超過0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建議僅使用0.4-0.6cm長的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用genotyping，使用0.2-0.3cm長的尾尖已經足夠。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。并確保鼠尾浸沒在裂解液內。裂解完全通常需6-8小時。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對抽提效果無任何負面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補救措施，可以把整個反應體系放大一倍。
c．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步驟(步驟2.c)的情況下，會導致最后獲得的總DNA含有少量的RNA。如果殘余的少量RNA對后續(xù)實驗沒有干擾，可以不進行本步實驗操作，直接進入步驟d。
d．按照等體積混合適當體積的樣品裂解液B和無水乙醇，Vortex混勻。
每一個樣品，需混合200微升樣品裂解液B和200微升無水乙醇。如果有10個樣品，則需混合2ml樣品裂解液B和2ml無水乙醇，以此類推。配制好的樣品裂解液B和無水乙醇的等體積混合液，室溫放置，3個月內有效。必須Vortex充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。
e．最高速劇烈Vortex 15秒。加入400微升步驟d配制的樣品裂解液B和無水乙醇等體積混合液，劇烈Vortex混勻。
加入樣品裂解液B和無水乙醇的等體積混合液后可能會產生白色沉淀，屬正�，F(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉移到純化柱內，沉淀不會影響抽提效果。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內�！�6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉移到DNA純化柱內，否則會嚴重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘�！�12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。如果對于獲得較多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復洗脫一次。第二次洗脫可以增加產量10-80%，特別是當?shù)谝淮蜗疵撓聛淼腄NA大于10微克時，第二次洗脫可以獲得第一次洗脫時50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對洗脫效果的改善相對不太明顯。

3. 從培養(yǎng)的動物細胞中抽提總DNA
a．收集最多不超過500萬的細胞，離心沉淀后重懸于200微升PBS中。
PBS需自備。如果使用凍存的細胞沉淀，先把細胞沉淀解凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS。對于基因組DNA含量較高的細胞，例如Hela細胞，應使用較少的細胞，例如100-200萬Hela細胞。
b．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
在不做清除RNA的操作步驟(步驟3.b)的情況下，會導致最后獲得的總DNA含有小部分RNA。如果殘余的少量RNA對后續(xù)實驗沒有干擾，可以不進行本步實驗操作，直接進入步驟c。
c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后必須立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和樣品裂解液B混合。
e．加入200微升無水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。加入乙醇后可能會產生白色沉淀，屬正常現(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉移到純化柱內。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉移到DNA純化柱內，否則會嚴重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘。≥12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。如果對于獲得較多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復洗脫一次。第二次洗脫可以增加產量10-80%，特別是當?shù)谝淮蜗疵撓聛淼腄NA大于10微克時，第二次洗脫可以獲得第一次洗脫時50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對洗脫效果的改善相對不太明顯。

4. 從動物血液中抽提總DNA
本操作方法也適用于血沉棕黃層(buffy coat)和骨髓(bone marrow)的總DNA抽提。
a．取50-100微升紅細胞無細胞核的血，或5-10微升活細胞有細胞核的血。
人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的紅細胞無細胞核，鳥、魚、蛙等的紅細胞有細胞核。紅細胞有細胞核會導致相同體積的血液內DNA的含量非常高。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入PBS至總體積為220微升，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
e．轉步驟3.e。后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動物細胞中抽提總DNA”3.e起的步驟。
5. 從石蠟包埋的組織樣品中抽提總DNA
由于包埋的組織通常已經被固定，通常僅能獲得長度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蠟包埋組織樣品相對比較適合DNA的抽提，而有交聯(lián)作用的固定試劑(例如鋨酸)固定的組織則不適合用于抽提DNA。需自備二甲苯。
a．取一塊小于25mg的包埋塊，加入1.2ml二甲苯，劇烈Vortex，以充分脫臘。
b．臺式離心機最高速(12000-14000rpm)室溫離心5分鐘，棄上清。
注意，去除上清的時候要非常小心，不要把沉淀丟失了。
c．加入1.2ml無水乙醇，輕輕Vortex混勻，以去除殘留的二甲苯。
d．臺式離心機最高速(12000-14000rpm)室溫離心5分鐘，棄上清。
注意，去除上清的時候要非常小心，不要把沉淀丟失了。
e．重復步驟c和d一次，即再用乙醇洗滌樣品一次。
f．棄上清后再最高速離心1分鐘，用20微升槍小心吸除殘留的液體。
g．室溫放置數(shù)分鐘至乙醇全部揮發(fā)。
h．加入180微升樣品裂解液A。
i．轉步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。

6. 從甲醛固定的組織中抽提總DNA
由于組織已經被固定，通常僅能獲得長度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的組織樣品相對比較適合DNA的抽提，而有交聯(lián)作用的固定試劑(例如鋨酸)固定的組織則不適合用于抽提DNA。乙醇固定的組織可以參考甲醛固定的組織的抽提方法進行總DNA的抽提。
a．取不超過25mg的組織，用PBS洗滌兩次，以充分去除固定液。
b．去除PBS，轉步驟1.a，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.a起的步驟。

7. 從革蘭氏陰性菌中抽提總DNA
a．離心收集最多不超過20億個細菌，棄上清。
b．加入180微升樣品裂解液A，充分重懸細菌。
c．轉步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。

8. 從革蘭氏陽性菌中抽提總DNA
需自備溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2% Triton X-100，20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在臨使用前加入。
a．離心收集最多不超過20億個細菌，棄上清。
b．用180微升溶菌酶溶液充分重懸細菌。
c．37℃孵育30分鐘以裂解細菌。
d．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
e．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。
不可把蛋白酶K直接加入到樣品裂解液B中。
f．70℃孵育30分鐘。
g．轉步驟1.e，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.e起的步驟。

9. 從酵母中抽提總DNA
需自備用于裂解酵母的酶lyticase，并配制酵母裂解液：1M 山梨糖醇(sorbitol)，100mM EDTA，14mM 2-巰基乙醇。
a．離心收集最多不超過50萬個酵母，棄上清。
b．用600微升上述酵母裂解液重懸，加入200U lyticase，30℃孵育30分鐘。
注意：裂解的時間會隨酵母的種類不同而有所不同，詳細情況請參考lyticase的說明書。
c．300g離心10分鐘收集沉淀，棄上清。
d．沉淀用180微升樣品裂解液A重懸。
e．轉步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。

10. 從昆蟲中抽提總DNA
a．用液氮冷凍后研碎處理：
a).取最多不超過50mg昆蟲(例如果蠅)，液氮冷凍后研碎，轉移至1.5ml離心管中。
b).加入180微升樣品裂解液A。
c).轉步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。
b．用勻漿器勻漿處理：
a).取最多不超過50mg昆蟲(例如果蠅)。
b).加入180微升PBS，用電動勻漿器或玻璃勻漿器勻漿。
c).轉步驟3.b，后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動物細胞中抽提總DNA”3.b起的步驟。

11. 從其它樣品中抽提總DNA
對于某些樣品需使用特定的裂解液裂解，可以參考如下方法進行總DNA的抽提。
a．樣品用200微升特定的裂解液裂解。裂解需確保呈溶液狀態(tài)，如果有不溶物需通過離心沉淀去除。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入200微升樣品裂解液B，立即Vortex混勻。
d．70℃孵育10分鐘。
檢查整個溶液的pH值，確保pH值小于7.0，否則DNA結合到純化柱的效率會很低。
e．轉步驟1.e，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.e起的步驟。