小鼠破骨細(xì)胞分化方案升級版
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| 破骨細(xì)胞是高度分化的多核巨細(xì)胞，主要來源于單核/巨噬細(xì)胞造血干細(xì)胞系，是一種具有骨吸收功能，在骨代謝方面起著關(guān)鍵性作用的細(xì)胞，因而機(jī)體對于破骨細(xì)胞的調(diào)控非常嚴(yán)格，在破骨細(xì)胞分化成熟的過程中，RANK /RANKL/OPG系統(tǒng)起著分化調(diào)控樞紐的作用，是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵信號途徑。核因子κB 受體活化因子配體（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand ，RANKL）被認(rèn)為是促進(jìn)破骨細(xì)胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，M-CSF可誘導(dǎo)RANK在破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞膜上表達(dá)，進(jìn)而使表達(dá)RANK的破骨前體細(xì)胞和RANKL結(jié)合并產(chǎn)生效應(yīng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。因此在體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中RANKL和M-CSF兩種細(xì)胞因子缺一不可。 |
| 然而有不少科研工作者在誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞（尤其是小鼠破骨細(xì)胞）時(shí)會(huì)遇到誘導(dǎo)不穩(wěn)定，誘導(dǎo)效率低等問題，PeproTech技術(shù)部門通過實(shí)驗(yàn)總結(jié)以及查閱文獻(xiàn)對誘導(dǎo)失敗原因進(jìn)行了分析： ▼ 破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)是通過破骨前體細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，因此細(xì)胞的密度對融合很關(guān)鍵，人的破骨細(xì)胞體外分化通常由單核細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，由于是分選的細(xì)胞，純度很高，在誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞不會(huì)增殖，因此細(xì)胞密度可控，誘導(dǎo)成功率高；而小鼠的破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化是選擇骨髓細(xì)胞來進(jìn)行誘導(dǎo)，骨髓細(xì)胞里面雖然有很多破骨前體細(xì)胞，但是在誘導(dǎo)分化過程中其它雜細(xì)胞會(huì)影響細(xì)胞之間的融合，此外在前期擴(kuò)增過程中，細(xì)胞生長速度的差異最終會(huì)引起細(xì)胞密度的不可控，最終也會(huì)影響細(xì)胞的融合，導(dǎo)致誘導(dǎo)分化的失敗。 |
| 為了給客戶解決這一問題，PeproTech技術(shù)部門通過實(shí)驗(yàn)操作驗(yàn)證總結(jié)了一個(gè)新的小鼠破骨細(xì)胞誘導(dǎo)誘導(dǎo)方案，供大家參考！ |
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1. 小鼠骨髓細(xì)胞的獲得 1.1 小鼠(6~8周)頸椎脫臼法處死，將處死的小鼠放于含有酒精的小燒杯中浸泡2 min，消毒滅菌，在超凈臺(tái)中手術(shù)取出所有的脛骨和股骨，并用剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈； 1.2 將取好的骨頭轉(zhuǎn)移到裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，涮洗一次后轉(zhuǎn)移至另一個(gè)裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿； 1.3 用剪刀剪去骨的兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別插入兩端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反復(fù)沖洗骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨完全變白； 1.4 收集骨髓懸液，用篩網(wǎng)過濾去除小碎片和肌肉組織； 1.5 將濾過液500 g/5 min離心，棄去上清； 1.6 將離心后的沉淀彈散，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液(1X)（Cat#64010-00-100），室溫裂解5 min 注：推薦使用BioGems紅細(xì)胞裂解液，裂解溫和，對骨髓細(xì)胞損傷��！ 1.7 加入10 ml完全培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+雙抗)終止裂解，然后500 g/5 min離心，棄去上清； 1.8 將離心后的沉淀彈散，用完全培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+雙抗)重懸細(xì)胞，至此已獲得小鼠骨髓細(xì)胞。 2. 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化 2.1 將細(xì)胞重懸到1-2*106/ml，加入終濃度為30ng/ml的小鼠M-CSF，按10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入10ml細(xì)胞懸液鋪板，隔天換液一次，誘導(dǎo)分化5天待細(xì)胞長到80-90%密度，鏡下細(xì)胞都貼壁生長。 2.2 棄去培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，加入PBS清洗細(xì)胞一次，加入一定量的胰酶在37℃進(jìn)行消化，待細(xì)胞開始變松散后加入血清及時(shí)終止消化，輕柔吹打細(xì)胞，將細(xì)胞收集到15ml離心管內(nèi)，離心棄去上清。 3. 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 3.1. 用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+30ng/ml Murine M-CSF+50ng/ml Murine RANKL）重懸細(xì)胞。 3.2. 請按下表鋪入細(xì)胞數(shù)及對應(yīng)的體積： |
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3.3 培養(yǎng)分化3~5天，隔天換液，一般在培養(yǎng)分化的第三天可以看到細(xì)胞融合，多個(gè)核細(xì)胞形成，此后要及時(shí)觀察融合情況，因?yàn)槿诤虾蟮钠乒羌?xì)胞體外生存時(shí)間較短，容易破裂，要挑選合適的時(shí)間終止分化，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。 注：細(xì)胞因子購買后請按照說明書指示溶解并稀釋保存，不可反復(fù)凍融，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基請根據(jù)每次的用量配制，用多少，配制多少。 |
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| 誘導(dǎo)結(jié)果： |
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聯(lián)系電話：40000 53055,0512 6832 5983
E-mail：peprotech.infochina@thermofisher.com
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