培養(yǎng)細(xì)胞時為何要凍存一定數(shù)量的細(xì)胞？

有何意義？

細(xì)胞凍存的意義：

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)并將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其它意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。 

△  細(xì)胞培養(yǎng)過程

若直接凍存細(xì)胞，不加任何試劑時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。

如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，DMSO對與細(xì)胞的毒性根據(jù)濃度確定，甘油對細(xì)胞無毒性，兩者分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

△  對比圖

細(xì)胞凍存復(fù)蘇遵循的原則是：慢凍快融

慢凍大家可參考之前的文章：細(xì)胞凍存的那些事兒~

今天我們來聊聊~  細(xì)胞復(fù)蘇時需要注意的那些事兒~

細(xì)胞復(fù)蘇的原則：

快速融化

必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

復(fù)蘇步驟

一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

• 將水浴鍋預(yù)熱至37℃。

• 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面。

• 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等。

二．取出凍存管：

• 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

• 從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。

三．迅速解凍：

• 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動，使管中的液體迅速融化。

• 約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

四.平衡離心：

• 用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中1000r/min，離心5min。

五.制備細(xì)胞懸液：

• 吸棄上清液。

• 向離心管內(nèi)加入10ml預(yù)熱的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

• 用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：

• 細(xì)胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

七.培養(yǎng)細(xì)胞：

• 將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定。

八. 記錄復(fù)蘇日期：

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面最容易出問題的部分，因此必須注意以下幾點(diǎn)~

• 注意無菌操作。

• 取細(xì)胞的過程中可能會接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。

• 此項(xiàng)尤為重要，如果凍存管密封不嚴(yán)，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸，所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套，復(fù)蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。

• 應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)溫速度太慢，則會造成細(xì)胞損傷。另外，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。

• 細(xì)胞復(fù)蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮取出的細(xì)胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋。

• 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細(xì)胞的損傷。

• 細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時1ml細(xì)胞液要加10ml－15ml培養(yǎng)液，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。

• 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。

• 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會比較大，就會影響細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響。還有一個說法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。    

   

初學(xué)者最易犯的錯誤：

• 水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。

• 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。

• 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

• 一次復(fù)蘇細(xì)胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

 解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會造成細(xì)胞生長不良，甚至死亡，像水土不服一樣。

結(jié)果分析：

判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長，達(dá)到正常的生長特性（比如細(xì)胞群體倍增時間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲存數(shù)量。

 

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