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Dispendix I-DOT非接觸式微量分液系統(tǒng)在qPCR樣品準(zhǔn)備的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：3743　發(fā)布日期：2020-9-23　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)必備技能。相比于常規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)，real-time qPCR靈敏度高，重復(fù)性好，已經(jīng)被用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，比如基因的差異表達(dá)分析，SNP檢測(cè)，等位基因的檢測(cè)，藥物開(kāi)發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。它是對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期間，Ct值（qPCR中起始模板擴(kuò)增達(dá)到一定產(chǎn)物量時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)）和該模板的起始cDNA拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以Ct值成為特定基因定量的依據(jù)。

由于最終結(jié)果中1個(gè)Ct的差異將反映初始模板的2倍拷貝數(shù)的差異，因此為了減少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏差，通常要求實(shí)驗(yàn)結(jié)果中同一樣本不同副孔的Ct值偏差越小越好，比如三副孔之間偏差小于0.3個(gè)Ct，甚至更低。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，在qPCR實(shí)驗(yàn)的全流程中，擴(kuò)增樣品反應(yīng)體系配制的精準(zhǔn)度是非常重要的，它很大程度決定了后期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可信度。

同時(shí)，由于基礎(chǔ)研究的效率提升，或者檢測(cè)類(lèi)的指標(biāo)組合較多，通常在一次qPCR實(shí)驗(yàn)中，研究人員期望對(duì)多個(gè)cDNA模板進(jìn)行多個(gè)基因的檢測(cè)，這些模板可能來(lái)自于不同種類(lèi)的樣本，不同時(shí)間點(diǎn)的樣本。每個(gè)cDNA模板又同時(shí)需要檢測(cè)內(nèi)參基因。模板和引物的每個(gè)組合通常都會(huì)做3~4個(gè)副孔，這樣算下來(lái)，一次qPCR實(shí)驗(yàn)至少要一塊96孔板或者384孔板，甚至更多板子。96孔板和384孔板中的qPCR反應(yīng)體系常規(guī)設(shè)置為20ul和10ul，有時(shí)候?yàn)榱斯?jié)約試劑做更多的檢測(cè)指標(biāo)，會(huì)將反應(yīng)體系分別降低到10ul和5ul。

I-DOT助力qPCR樣品準(zhǔn)備

那么針對(duì)如此復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)組合和小體積的qPCR樣品配制，傳統(tǒng)手動(dòng)配制的方式，如下面的問(wèn)題，你是否都遇到過(guò)？而這些問(wèn)題，通過(guò)德國(guó)DispendiX公司的I-DOT非接觸式微量分液系統(tǒng)可以完全解決。

傳統(tǒng)手動(dòng)配制方式 VS I-DOT自動(dòng)配制方式

I-DOT qPCR操作流程詳解

我們以如下一個(gè)復(fù)雜的384孔的qPCR實(shí)驗(yàn)為例，整板實(shí)驗(yàn)包含了對(duì)8個(gè)cDNA模板進(jìn)行16個(gè)引物對(duì)的檢測(cè)，每個(gè)組合設(shè)置了3個(gè)副孔的實(shí)驗(yàn)。設(shè)定實(shí)驗(yàn)總體積為10ul，其中含有DNA結(jié)合探針/染料的Master mix為5ul，cDNA模板3ul，引物2ul（此處為了簡(jiǎn)化模擬實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，將相�?duì)均勻地分配10ul體系的組合，實(shí)際情況中，會(huì)使用到更低體積的模板或者引物）。

01 排兵布陣

在軟件Target Layout中通過(guò)選擇、復(fù)制、移動(dòng)的方式設(shè)置實(shí)驗(yàn)孔在qPCR板中的分布圖，如上復(fù)雜的384實(shí)驗(yàn)設(shè)置在5分鐘內(nèi)可完成，設(shè)置完成后，軟件記錄了每個(gè)孔需要使用到的Master mix的體積，模板的種類(lèi)和體積，引物的種類(lèi)和體積，并同步計(jì)算整塊384孔板所使用到的所有的液體種類(lèi)和體積。無(wú)需任何人工計(jì)算。

02 自動(dòng)分配

在軟件Source Layout中對(duì)照分布圖，使用移液器將對(duì)應(yīng)的液體種類(lèi)的對(duì)應(yīng)體積加入到對(duì)應(yīng)的96孔pure plate板（母液板）中

03 對(duì)號(hào)入座 & 模擬分配

將全新的qPCR板和已經(jīng)加入待分配液體的pure plate板放入I DOT機(jī)器中，在Overview界面檢查模板設(shè)置和進(jìn)行模擬分配（模擬分配也可省略）

04 一鍵啟動(dòng)

啟動(dòng)液體分配工作，5~15分鐘完成自動(dòng)分液工作。

05 分配完成 & 質(zhì)量監(jiān)控

I-DOT軟件的DropDetection功能可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分液過(guò)程中的每一滴液滴，以及液滴中的氣泡，這一簡(jiǎn)單有力的工具確保了液滴的有效分配和實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)化。DropDetection通過(guò)嵌置在樣品板下方的電路板形成96個(gè)微小的光路屏障，檢測(cè)不同位置樣品孔中噴射出的液滴通過(guò)光路屏障時(shí)光強(qiáng)度的變化。在液體分配結(jié)束后，DropDetection可提供基于顏色編碼或文本的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。