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01 細(xì)胞準(zhǔn)備篇

問：組織消化選擇什么消化液，消化多長(zhǎng)時(shí)間？

答：組織的消化液有兩種，一種是EDTA,另一種是膠原酶，EDTA適合消化空腔性器官，例如小腸和胃；膠原酶消化比較廣泛，一般會(huì)搭配DNA酶一起使用，基本適合所有組織的消化。不同組織消化時(shí)間差異比較大，從十幾分鐘到數(shù)時(shí)小時(shí)都有。

問：消化的溫度如何選擇？

答：EDTA消化可以在冰上進(jìn)行，膠原酶的消化需要37℃，這樣酶的活性最高。

問：基質(zhì)膠培養(yǎng)之前，如何篩出干性細(xì)胞？

答：如果是單細(xì)胞，并且已知干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，可以通過流式分選或者磁珠分選。

問：類器官的培養(yǎng)必須要細(xì)胞具有干性嗎？正常組織成熟體細(xì)胞可以做類器官培養(yǎng)嗎？

答：只有干細(xì)胞擴(kuò)增來源的培養(yǎng)物才能稱之為類器官，因此干性是必要條件。正常組織的成熟體細(xì)胞中往往會(huì)有一部分成體干細(xì)胞（標(biāo)志物為L(zhǎng)gr5，CD133等），這部分細(xì)胞可以進(jìn)行類器官培養(yǎng)。

問：如何選擇構(gòu)建類器官的來源細(xì)胞？

答：理論上所有類器官都可以選擇從ESC/IPSC來構(gòu)建，部分類器官可以選擇從組織中分離成體干細(xì)胞來構(gòu)建，成體干細(xì)胞來源的類器官其構(gòu)建周期短，體外傳代次數(shù)多，相對(duì)而言構(gòu)建成本低；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，如果要通過類器官模型來研究器官的發(fā)育，需要對(duì)起始細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，一般都是通過ESC/IPSC來構(gòu)建類器官。

02 類器官培養(yǎng)篇

問：類器官培養(yǎng)需要多長(zhǎng)時(shí)間？

答：如果選擇從ESC/IPSC來構(gòu)建類器官，需要1-2月(甚至更長(zhǎng))才能構(gòu)建成功，如果是選擇從成體干細(xì)胞來構(gòu)建類器官，一般只需要1-2周就可構(gòu)建成功。

問：基質(zhì)膠如何重懸細(xì)胞？

答：用基質(zhì)膠去混細(xì)胞時(shí)，可以直接用基質(zhì)膠去重懸細(xì)胞；也可以用培養(yǎng)基：基質(zhì)膠=1:1的比例稀釋后重懸細(xì)胞，但是不推薦更大比例稀釋基質(zhì)膠，因?yàn)榧尤脒^多的培養(yǎng)基時(shí)，膠滴容易散開，整個(gè)重懸過程在冰上操作，重懸細(xì)胞時(shí)禁止產(chǎn)生氣泡。

問：不同孔板培養(yǎng)類器官培養(yǎng)所需的基質(zhì)膠和培養(yǎng)基體積?

答：類器官常用24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，一般每孔種一個(gè)50μl的膠滴，加入500μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；6孔板每孔可以種多個(gè)50μl的膠滴，加入2ml培養(yǎng)基覆蓋膠滴；96孔板一般每孔種一個(gè)10μl的膠滴，加入200μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴。

問：基質(zhì)膠可否反復(fù)凍融？

答：基質(zhì)膠不建議反復(fù)凍融，偶爾凍融一兩次沒問題，多次凍融會(huì)影響基質(zhì)膠內(nèi)蛋白活性，但是要注意，基質(zhì)膠凝固后不建議再用了。

03 類器官傳代篇

問：類器官傳代時(shí)如何收獲類器官？如何將類器官分散開？

答：基質(zhì)膠在4℃時(shí)會(huì)變得很軟，吹打后可將基質(zhì)膠分散開。通過離心去除上清液里的基質(zhì)膠，收集的類器官重懸后可通過機(jī)械力吹打進(jìn)行解離；也可以選擇用Cell recovery solution來消化基質(zhì)膠，使基質(zhì)膠溶解，通過離心去除上清液里的基質(zhì)膠，Cell recovery solution對(duì)細(xì)胞團(tuán)消化作用不明顯，因此更多時(shí)候類器官傳代需要使用消化酶(包括胰酶)消化成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。

問：類器官傳代一般怎么傳��？

答：先把基質(zhì)膠消化掉，可以對(duì)類器官消化(消化酶處理)或不消化(機(jī)械力吹打)。傳代通常按照1:2、1:3、1:4甚至1:10的比例都有傳代成功的例子。

問：如果傳代，有沒有對(duì)前一代類器官數(shù)量的要求？

答：由于傳代過程中類器官會(huì)有損失，因此類器官傳代時(shí)對(duì)前一代理論上有一定的數(shù)量要求，如類器官數(shù)量較少、尺寸較小、活性較差等都會(huì)影響傳代培養(yǎng)效果。類器官傳代須在類器官數(shù)量較多，且細(xì)胞狀態(tài)較好時(shí)進(jìn)行。傳代時(shí)酶解或吹打盡量輕柔以免損傷細(xì)胞。并且傳代操作時(shí)盡量避免反復(fù)操作以免造成較大的細(xì)胞損失。

04 腫瘤類器官篇

​問：腫瘤類器官的培養(yǎng)是否也會(huì)生成正常的類器官，是否會(huì)影響藥敏測(cè)試的結(jié)果？

答：腫瘤類器官來源即為腫瘤組織，即使存在部分正常細(xì)胞，也是腫瘤微環(huán)境的一部分，且正常細(xì)胞的干性、增殖能力弱于腫瘤細(xì)胞，因此類器官建立后其大部分細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，少數(shù)正常細(xì)胞基本不會(huì)影響藥敏測(cè)試。

問：培養(yǎng)腫瘤類器官需要原始腫瘤組織的大小是多少？活檢樣本量足夠嗎？

答：腫瘤類器官培養(yǎng)所需手術(shù)組織大概需要3顆黃豆大小以上，穿刺活檢樣本需要至少3針，內(nèi)鏡活檢至少鉗取6顆以上。因腫瘤異質(zhì)性較大，建議可以取腫瘤組織不同部位分別進(jìn)行類器官培養(yǎng)。

問：腫瘤類器官培養(yǎng)后能否建系？

答：部分腫瘤類器官是具有長(zhǎng)期培養(yǎng)和穩(wěn)定傳代的能力的，這類類器官可用于建系，但不是所有類器官都可以建系。

05 類器官鑒定篇

問：如何去鑒定培養(yǎng)的類器官是否成功?

答：看類器官大小、結(jié)構(gòu)以及是否具有特殊形態(tài)。一般初次培養(yǎng)，最好進(jìn)行HE、免疫熒光、基因測(cè)序鑒定。