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細(xì)胞培養(yǎng)過程中的支原體污染的來源與控制方法

瀏覽次數(shù):1745 發(fā)布日期:2020-5-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
Mycoplasma國內(nèi)主要有三種譯名,醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)譯為“支原體”(分枝原體,枝原體,類菌質(zhì)體),動物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)譯為“霉形體”或“支原體”,臺灣、香港則譯為微漿菌。

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細(xì)胞型微生物。自然界分布廣泛,種類多,有80余種,分為兩個屬:一為支原體屬(Mycoplasma),有幾十個種;另一為脲原體屬(Ureaplasma),僅有一種。與人類感染有關(guān)的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。

支原體無細(xì)胞壁,多呈不規(guī)則球狀、長絲狀,可分枝,營寄生共生或腐生。一般侵害對象為動植物,可造成多種疾病。

細(xì)胞培養(yǎng)(特別是傳代細(xì)胞)被支原體污染是個世界性問題。國內(nèi)外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和菜氏無膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。國外調(diào)查證明,大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞,有的細(xì)胞株可以同時污染兩種以上的支原體。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(某些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染,等等。
體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力,因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染(如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等)、無其他對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染(如抗體、補體)。對于天然培養(yǎng)基,污染主要來源于取材過程及生物材料本身,應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材,嚴(yán)格操作。對于合成培養(yǎng)基,污染主要來源于配制過程,配制所用的水,器皿應(yīng)十分潔凈,配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。

由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力,而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限,因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。支原體污染后,因為它們不會使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存,培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁,細(xì)胞無明顯變化,外觀上給人以正常感覺,實則細(xì)胞受到多方面潛在影響,如引起細(xì)胞變形,影響DNA合成,抑制細(xì)胞生長等。

組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中,可以從以下幾方面來預(yù)防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴(yán)格實驗操作;細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌;在細(xì)胞培養(yǎng)基沖加入適量的抗生素。

抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液,是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不嚴(yán)重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同,應(yīng)根據(jù)需要選擇。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞甚多,培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時,應(yīng)該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化,培養(yǎng)液也不渾濁。

從2013年開始,《Nature》期刊已正式要求涉及細(xì)胞培養(yǎng)的投稿文章,要求必須進(jìn)行支原體檢測,截止目前,大量的SCI期刊都跟進(jìn)這項要求。為了提高動物細(xì)胞培養(yǎng)生物制品的質(zhì)量和安全性,中華人民共和國藥典規(guī)定主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、病毒種子批、對照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行支原體檢測。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定,應(yīng)該用合適的方法檢測細(xì)胞的支原體污染狀況。歐洲藥典規(guī)定對細(xì)胞治療產(chǎn)品需要進(jìn)行嚴(yán)格的支原體檢測。以上這些要求和規(guī)定,再加上支原體的特性和污染的后果都指向一點——支原體分子檢測成為細(xì)胞培養(yǎng)必不可少的環(huán)節(jié)。先達(dá)基因研發(fā)了一種細(xì)胞污染支原體檢測試劑盒,每次檢測只需半個小時,減少了很多工作量其原理是基于公司自主開發(fā)的實時熒光恒溫核酸檢測技術(shù)(ERA),可以在恒定的低溫下(25℃-42℃)對痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴增,擴增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成,該試劑盒檢測范圍涵蓋130種支原體。

支原體污染細(xì)胞后,特別是重要的細(xì)胞株,有必要清除支原體,常用方法有:抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。要注意的是:支原體沒有細(xì)胞壁,故作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素,如內(nèi)酰胺類、萬古霉素等是不敏感的;對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等,氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時更換所有培養(yǎng)用物。通常,濾過除菌的方法對支原體是沒有作用的。

由于一些微生物,如支原體,病毒等能通過濾膜,所以過濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險,近年來,6Co輻射滅菌技術(shù)在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,由于輻射滅菌能夠徹底殺滅所有微生物。有試驗證實以2Mrad輻射處理的各培養(yǎng)基樣品達(dá)到了無菌要求,經(jīng)多批培養(yǎng)試驗,輻射滅菌安全可靠;輻射滅菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)性能不低于過濾組,證明輻射滅菌對培養(yǎng)基性能無不良影響;對血清的輻射滅菌試驗效果也表明60COγ射線不影響培養(yǎng)效果。把干粉培養(yǎng)基經(jīng)無菌操做定量分裝于滅菌容器內(nèi),輻射后以干粉原型貯藏,不但培養(yǎng)基的純凈性得到保障,而且營養(yǎng)性能較過濾后以水溶液形式保存更穩(wěn)定,對谷氨酰胺等這類水溶液不穩(wěn)定者特別合適。
來源:蘇州先達(dá)基因科技有限公司
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