隨著繼續(xù)優(yōu)化此方案，將上傳更新的版本，有興趣使用患者樣品測(cè)試該方案的科研團(tuán)隊(duì)可以通過(guò)發(fā)送電子郵件，請(qǐng)求指導(dǎo) sherlock@broadinstitute.org，并且可應(yīng)要求提供有限數(shù)量的Cas13酶、crRNA和側(cè)向報(bào)道基因的起始樣品）
（重要說(shuō)明：此協(xié)議不得用于臨床目的，因?yàn)樗麄儫o(wú)法獲取患者樣本，因此無(wú)法使用真實(shí)的患者樣本來(lái)驗(yàn)證該測(cè)定。）
一、概述
臨床醫(yī)生和科學(xué)家們目前雖然可以使用qPCR，來(lái)診斷新型冠狀病毒COVID-19，但由于試劑和設(shè)備的不足，可能一定程度上減慢疾病檢測(cè)的速度。為了幫助推進(jìn)COVID-19的診斷，在此描述一種基于CRISPR的SHERLOCK(高靈敏度酶促解鎖）技術(shù)，檢測(cè)COVID-19的方案。使用合成的COVID-19病毒RNA片段，能夠在20到200 aM（每微升輸入10-100拷貝數(shù)）之間一致地檢測(cè)COVID-19靶序列。從用于qRT-PCR測(cè)試的核酸提取開(kāi)始，本檢測(cè)方案分為三個(gè)步驟，并且可以在1小時(shí)內(nèi)完成。
步驟（1）孵育25分鐘（使用重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）試劑盒等溫?cái)U(kuò)增提取的核酸樣品）；
步驟（2）孵育30分鐘（使用Cas13檢測(cè)預(yù)先擴(kuò)增的病毒RNA序列）；
步驟（3）孵育2分鐘（使用的試紙/層析紙讀取檢驗(yàn)結(jié)果）。
以下各節(jié)詳細(xì)介紹了所需的試劑和步驟。
二、標(biāo)本和核酸提取：
應(yīng)根據(jù)適當(dāng)?shù)纳�物安全程序收集患者樣本，參�?020 CDC COVID-19方案，有關(guān)樣本收集和后續(xù)核酸提取的詳細(xì)信息。從步驟（1）開(kāi)始，此方案的輸入可以是與qRT-PCR分析中使用相同的核酸。
A材料和試劑
試劑：重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）試劑盒（TwistAmp®Basic；TABAS03KIT)；ProtoScript®II逆轉(zhuǎn)錄酶（M0368L）；裂解緩沖液（在ddH2O中為400mM Tris pH 7.4）；RNA酶抑制劑；T7 RNA聚合酶；核糖核苷酸溶液套裝；氯化鎂溶液；用于稀釋Cas13蛋白原液的存儲(chǔ)緩沖液（結(jié)合2.5 mL 1M Tris pH 7.4、6mL 5M NaCl，2.5 ml甘油和100μL1M DTT和38.9 ml ddH2O）；LwaCas13a蛋白；HybriDetect試紙條（MGHD 1)。
設(shè)備：37℃水浴鍋、42℃水浴鍋、微量離心機(jī)，適配1.5mL EP管。
引物：
靶向S基因的RPA擴(kuò)增引物對(duì)
S-RPA-Forward_v1：
5’-GAAATATACTACGACGACTGATCACATACTACTTCTGTT TACATAGA-3’；
S-RPA-Reverse_v1:
5′-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
針對(duì)Orf1ab引物對(duì)
Orf1ab-RPA-Forward_v1：
5’-GAATAATATACGACTACGGAGGAGTGTGAGATAGACATATActAAAC-3’；
Orf1ab-RPA-Reverse_v1:
5′-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3’；
用于檢測(cè)S基因的LwaCas13acrRNA
S-crRNA_v1：
5’-GuuuAgAccCCAAACAGGAGGACUCAAACAGCGACCACAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3；
用于檢測(cè)Orf1ab基因的LwaCas13acrRNA
Orf1ab-crRNA_v1：
5’-GuuuaGaCuCCAAACAGGAGGGACUACAUACACUCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3’；
讀出橫向血的報(bào)告基因RNA：
Lateral-Flow-Reporter：
5′-/56-FAM / mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3’；
陽(yáng)性對(duì)照序列（可以使用T7轉(zhuǎn)錄從合成的DNA寡核苷酸產(chǎn)生）：
新冠病毒S基因片段：
5’UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUAC
AUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUG
GACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAA
CCUAGGACUUUCUCUUUAAUAAAUAUAAUGAAAAUGGAACC
AUGACUGUACAGAUGCUGAGAU
新冠病毒Orf1ab基因片段：
5’GAAAUUAAUACGACUCACUAUAGGGACUCUUGAAACUG
CUCAAAAUUCUGUGCGUGUUUACAGAAGGCCGCUAUAACAA
UACUAGAUGGAAUUUCACAGUAUUCACUGAGACUCAUUGAAUUG
CUAUGACUUCAUGAUGAUUCACAUCUGAUUUGGCUACUAACAU
AUAUACUAUGACUUGAUCUGAUCUGAUCCUAU
B實(shí)驗(yàn)步驟：
提示：為防止樣品污染，需使用兩個(gè)不同的工作區(qū)域來(lái)執(zhí)行步驟（1）和（2）。步驟（1）應(yīng)該在前置放大區(qū)域中進(jìn)行，其對(duì)污染非常敏感。請(qǐng)勿在步驟（1）的工作區(qū)域中打開(kāi)擴(kuò)增的樣品，步驟（2）、步驟（3）需要一個(gè)單獨(dú)的區(qū)域（擴(kuò)增后區(qū)域）執(zhí)行。所有反應(yīng)應(yīng)在指定溫度下孵育之前在冰上進(jìn)行。
步驟（1）等溫?cái)U(kuò)增：
1、為了測(cè)試每個(gè)樣品，設(shè)置兩個(gè)RPA反應(yīng)，分別檢測(cè)S基因靶標(biāo)和Orf1ab靶標(biāo)。此外，可以使用合成病毒片段建立S基因和Orf1ab的陽(yáng)性對(duì)照。還應(yīng)建立不添加測(cè)試樣品的陰性對(duì)照。使用RPA試劑盒中提供的29.5ul的Rehydration Buffer重懸每個(gè)凍干的RPA沉淀。

2、對(duì)于S基因，可以如下設(shè)置每個(gè)反應(yīng)：

3、對(duì)于Orf1ab基因，可以如下設(shè)置每個(gè)反應(yīng)：

4、充分混合后，在預(yù)熱的水浴中于42°C孵育25分鐘。孵育結(jié)束后，立即將EP管放回冰上，直到準(zhǔn)備加入步驟（2）中的反應(yīng)中。

步驟（2）使用Cas13檢測(cè)病毒RNA序列
1、取一份LwaCas13a儲(chǔ)備蛋白的等分試樣（2 mg/mL，4 ul），使用122.5 uL的存儲(chǔ)緩沖液重懸。
2、對(duì)于每個(gè)S基因RPA反應(yīng)，按以下步驟建立Cas13檢測(cè)反應(yīng)：

3、對(duì)于每個(gè)Orf1ab基因RPA反應(yīng)，如下設(shè)置Cas13檢測(cè)反應(yīng)：

4、設(shè)置完所有反應(yīng)后，渦旋充分混合，并使用臺(tái)式離心機(jī)離心，接下來(lái)在預(yù)熱的37°C水浴鍋中于孵育30分鐘。孵育后，將反應(yīng)管放回冰上，繼續(xù)進(jìn)行步驟（3）。
步驟（3）–通過(guò)試紙條直觀地讀取檢測(cè)結(jié)果
1、步驟（2）之后，向每個(gè)20ul反應(yīng)物中添加80ul HybriDetect分析緩沖液并充分混合，將稀釋的反應(yīng)液置于室溫下的管架中。
2、將HybriDetect試紙條放入每個(gè)反應(yīng)管中，然后等待反應(yīng)流過(guò)試紙條。
3、陽(yáng)性對(duì)照樣品應(yīng)顯示兩條線，而陰性對(duì)照樣品應(yīng)僅顯示底線。
4、對(duì)于每個(gè)測(cè)試樣品，檢查S和Orf1ab基因是否都出現(xiàn)兩行，表明新冠病毒結(jié)果呈陽(yáng)性。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
使用合成新冠病毒S基因和Orf1ab基因RNA片段的梯度稀釋液，能夠檢測(cè)到每微升10-100拷貝的合成新冠病毒RNA序列的。以下是針對(duì)不同輸入濃度的示例圖像：

四、附加信息：
可以在以下參考中找到用于設(shè)置基于SHERLOCK檢測(cè)的詳細(xì)通用方案：
SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, and Zhang F. Nature Protocols. 2019 Oct;14(10):2986-3012. doi: 10.1038/s41596-019-0210-2.

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