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液滴微流控(六):單細(xì)胞高通量液滴測序(Drop-seq)

瀏覽次數(shù):4534 發(fā)布日期:2020-5-12  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)與功能的基本單位,形態(tài)類型千差萬別。通過細(xì)胞基因組學(xué),可以描述細(xì)胞特性及功能,本文所介紹的單細(xì)胞(single-cell)高通量液滴測序(Drop-seq)技術(shù),是一種快速分析成千上萬個單細(xì)胞的方法,通過將每個細(xì)胞包裹在納升級微滴中,進(jìn)行RNA雜交并生成mRNA轉(zhuǎn)錄物,制作細(xì)胞基因表達(dá)譜,進(jìn)一步可分析mRNA轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞。
 
原理簡述

Drop-Seq基于液滴微流控技術(shù),首先,將細(xì)胞懸浮液與帶有分子條形碼的微珠懸浮液泵至微流控芯片,匯聚并形成層流,之后再與油相匯聚,形成單分散的微滴,將每個細(xì)胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中,隨后完成RNA雜交并裂解微滴,釋放mRNA雜交物,完成逆轉(zhuǎn)錄,最后,以PCR方式完成核酸擴(kuò)增,并進(jìn)行測序分析。
 
測序過程

1.準(zhǔn)備材料:從組織中分離細(xì)胞,制備細(xì)胞懸浮液;制備帶有分子條形碼的微珠懸浮液。
2.制備微滴:將細(xì)胞懸浮液與微珠懸浮液泵至芯片,再與油相匯聚形成單分散的微滴,將每個細(xì)胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中。
 

3.RNA雜交:裂解微滴中的細(xì)胞,細(xì)胞釋放mRNA,與微珠上的分子條形碼雜交。

4.逆轉(zhuǎn)錄:裂解微滴,釋放mRNA雜交物,開始逆轉(zhuǎn)錄,以形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄物(STAMPS)。
5. PCR擴(kuò)增:在核酸外切酶的作用下,將每條mRNA逆轉(zhuǎn)錄物“切下”,并以PCR方式進(jìn)行核酸擴(kuò)增,以放大基因信息。
6.測序分析:使用各種生物信息學(xué)工具進(jìn)行測序分析。
為什么用液滴微流控?
液滴微流控將微體積樣本快速分離,可實(shí)現(xiàn)成千上萬個細(xì)胞的平行高通量分析,通常情況下,每秒可產(chǎn)生1000個微滴,每個微滴的體積為1nL,因此在試劑量上來講,成本將成千倍的降低,此外,其實(shí)驗(yàn)過程無需用到流式熒光細(xì)胞儀等高端儀器,操作簡單、快捷。
液滴測序芯片圖解
此微流控芯片是開源的,開源鏈接:http://mccarrolllab.org/dropseq/。
液滴測序系統(tǒng)配置
液滴測序系統(tǒng)主要組件:
1.三個Flow EZ壓力泵或一個MFCS EZ壓力泵(四通道)。
2.三個流量監(jiān)測傳感器。
3.一個數(shù)字高速顯微鏡。
4.液滴測序微流控芯片。
 
Drop-Seq,其應(yīng)用遠(yuǎn)不止對細(xì)胞形態(tài)類型的識別。目前,基因組遺傳學(xué)研究正在研究識別許多導(dǎo)致疾病風(fēng)險的基因,但生物學(xué)缺乏類似液滴測序的高通量基因識別方法,此外,將液滴測序與突變、病原體刺激等微擾動相結(jié)合,可以對多種細(xì)胞進(jìn)行一個信息豐富的、多維度的解讀,揭示微擾動對細(xì)胞的影響。
 
參考文獻(xiàn):
[1]. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.
 
來源:北京燕京電子有限公司
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