做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候?yàn)槭裁匆�進(jìn)行細(xì)胞凍存呢？

細(xì)胞凍存有哪些好處呢？
 

1.  節(jié)省實(shí)驗(yàn)室空間、時(shí)間、經(jīng)費(fèi)

2.  若實(shí)驗(yàn)失敗，還有重來的機(jī)會(huì)

3.  確保重復(fù)實(shí)驗(yàn)的一致性

4.  確保未來實(shí)驗(yàn)的連貫性
 

但是，經(jīng)常會(huì)有用戶反映，細(xì)胞凍存與復(fù)蘇遇到了問題，看似簡(jiǎn)單的一步其實(shí)并不簡(jiǎn)單。

那么如何做好細(xì)胞凍存呢？今天跟隨我們一起來了解一下細(xì)胞凍存時(shí)需要注意的事項(xiàng)和技巧吧。

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細(xì)胞凍存的基本原理

細(xì)胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃時(shí)會(huì)集體罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使細(xì)胞代謝活動(dòng)近乎停止。細(xì)胞因此進(jìn)入休眠狀態(tài)，使細(xì)胞“不會(huì)老”，所以可以長期保存。

因?yàn)閮鋈谶^程對(duì)所有細(xì)胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發(fā)出有效的技術(shù)來防止細(xì)胞死亡和損傷。
 

▲ 細(xì)胞凍存過程

 

低溫保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞內(nèi)冰凍影響，目前多采用DMSO，甘油，乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護(hù)劑。它們的作用機(jī)制包括：自由進(jìn)入細(xì)胞，取代水，使冰點(diǎn)下降，充當(dāng)鹽的二次溶劑，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。如下圖所示：
 

▲ 使用和不使用凍存液對(duì)比圖

 

但是，部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過程中雖然會(huì)保護(hù)細(xì)胞，卻也會(huì)引起細(xì)胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會(huì)含有血清，因?yàn)檠�清可以降低�?xì)胞毒性。但，血清并不是完美的成分：

 

血清的優(yōu)勢(shì)	血清的缺點(diǎn)
有助于保護(hù)細(xì)胞	含有生長因子，激素等未知成分
	不推薦用于細(xì)胞庫，臨床應(yīng)用
	增加污染幾率
	成本波動(dòng)

▲ 血清優(yōu)缺點(diǎn)比較

 

那么有無動(dòng)物源成分替換物嗎？

甲基纖維素也被認(rèn)為是細(xì)胞冷凍保存的保護(hù)劑，所以可作為胎牛血清的替代物。

優(yōu)勢(shì)：

• 化學(xué)成分明確

• 有保護(hù)性

▲ 甲基纖維素結(jié)構(gòu)圖

 

盡管大多數(shù)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都存在優(yōu)化的冷凍保存方案和已發(fā)表的配方，但技術(shù)問題依然存在。

 

 

凍存液的選擇
 

首先我們需要明確首要任務(wù)是什么？我們的細(xì)胞需要什么？

回收率？

成活率？

凍存液成分？

無血清或無外源性要求？

我需要使用哪個(gè)方法？

商業(yè)培養(yǎng)基相比于自制培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)？

Biological Industries推出了一種即用型，無動(dòng)物源成分的凍存液：

 

下圖為NutriFreez™ D10凍存液適用的細(xì)胞類型：

 

▲ 細(xì)胞類型應(yīng)用舉例

 

Biological Industries使用不同細(xì)胞對(duì)NutriFreez™ D10凍存液與市面上一些凍存液進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)：
 

1. hMSC-BM

Biological Industries使用NutriFreez™ D10凍存液與市面上其他兩種凍存液對(duì)hMSC-BM細(xì)胞的存活率進(jìn)行了比較：

       

▲ 存活率                                                                ▲ 增殖率

 

▲ 細(xì)胞形態(tài)

如圖所示，所有不含血清的凍存液的細(xì)胞存活率都大于94%。然而，用NutriFreez™ D10冷凍保存的hMSC-BM細(xì)胞在生長3天后比其他產(chǎn)品更好的復(fù)蘇率，同時(shí)可以保持正常的細(xì)胞形態(tài)。

 

2. MSC
MSC細(xì)胞的存活率比較：

    

▲ 通過臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定存活率 

    

    ▲ 通過Annexin V/PI染色流式細(xì)胞儀分析存活率

通過圖示我們可以觀察出，NutriFreez™ D10凍存液的細(xì)胞存活率優(yōu)于自制和其他品牌。
 

復(fù)蘇后6天細(xì)胞增殖率：

▲ 細(xì)胞增值率 

同一來源的間充質(zhì)干細(xì)胞顯示使用NutriFreez™ D10凍存液的增殖率優(yōu)于其他產(chǎn)品和自制的凍存液。

復(fù)蘇6天后的細(xì)胞形態(tài)：

▲ 細(xì)胞形態(tài)圖

同一來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)恢復(fù)正常。
 

3. hESC

使用NutriFreez™ D10對(duì)hESC進(jìn)行凍存，如下圖是解凍后第1，2-4天的細(xì)胞形態(tài)和貼壁情況，表明了hESC有良好的復(fù)蘇率。

▲ 細(xì)胞形態(tài)圖

hESC（ H1）復(fù)蘇后多能性表面標(biāo)記物表達(dá)

▲ 標(biāo)記物表達(dá)

hESC（H1）復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)隨時(shí)間恢復(fù)良好，多能性hESC表面標(biāo)志物表達(dá)水平正常（A，B）。

 

相關(guān)資質(zhì)

Biological Industries同時(shí)也委托WiCell做了相關(guān)資格測(cè)試。

WiCell---美國領(lǐng)先的hESC細(xì)胞庫之一

WiCell測(cè)試表明在不影響未分化狀態(tài)和解凍后擴(kuò)增速率的情況下，用NutriFreez™ D10凍存液凍存的人多能干細(xì)胞在細(xì)胞的增殖、分化、形態(tài)及核型未受影響。

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  低溫凍存技巧   

冷凍凝固的過程中，水分會(huì)在0℃~-20℃區(qū)間形成不同形狀的結(jié)晶

在細(xì)胞凍存時(shí)“降溫速度、冰晶形成量和細(xì)胞滲透壓改變程度”是凍存成功與否的重要關(guān)鍵。

降溫速度慢：冰晶由細(xì)胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細(xì)胞內(nèi)水份移動(dòng)至細(xì)胞外造成細(xì)胞脫水。

降溫速度快：水分流動(dòng)時(shí)間短，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細(xì)胞內(nèi)造成大量胞內(nèi)冰晶形成，使得胞器損壞。

這些都可能引起細(xì)胞損傷、凋亡或壞死，也可能造成復(fù)蘇后細(xì)胞存活率低、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞功能喪失、基因變異等現(xiàn)象。

由此可知，最適合的凍存條件為“在增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性的溶液中，以慢到能減少胞內(nèi)冰晶形成，但也足夠快到能預(yù)防細(xì)胞脫水的降溫速度凍存細(xì)胞”。

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慢凍快融

1. 慢凍→兩種辦法：

手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時(shí)）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。

程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器，使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。

	程序降溫	手動(dòng)降溫
優(yōu)點(diǎn)	主動(dòng)監(jiān)控溫度 一些控制速率的冷凍機(jī)不需要任何可消耗的制冷劑	不需要任何特殊器皿 成本低
要求	受控速率凍結(jié)裝置 適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)瓶 專門的冷凍溶液	專門的冷凍溶液 -80℃冷凍機(jī) 液氮罐
長時(shí)間保存	液氮或低溫儲(chǔ)存（只要低于-135℃即可）	液氮

由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動(dòng)降溫。大家可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的凍存方式。

2. 快融：

將凍存在液氮中的細(xì)胞凍存管快速移至已37℃預(yù)熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進(jìn)入凍存管造成潛在污染），使細(xì)胞冷凍懸液迅速融化；此做法能讓細(xì)胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個(gè)結(jié)晶形成溫度范圍，避免冰晶進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成二次傷害。

FAQ

問 題	建 議
有毒的冷凍保存液	根據(jù)制造商的說明使用商業(yè)上可獲得的和定義的介質(zhì)。解凍后立即取出冷凍保護(hù)劑。避免細(xì)胞在室溫中置于低溫保護(hù)介質(zhì)中。
不適當(dāng)?shù)睦鋮s速率	使用-1℃/min的逐漸冷卻速度。要達(dá)到這個(gè)速度，可以使用保溫的冷凍容器或控制速度的冷凍機(jī)。
冷凍后的溫度變化	保持細(xì)胞在-130℃后的低溫。運(yùn)輸時(shí)要將細(xì)胞放在干冰上，并確保液氮中有充足的液氮。
不當(dāng)?shù)慕鈨鏊俾?/strong>	細(xì)胞必須迅速解凍，使用37℃的水浴解凍凍存管。
不正確的細(xì)胞密度	根據(jù)不同的細(xì)胞類型選擇凍存的細(xì)胞密度。典型的細(xì)胞密度凍存密度是1-10*106cells/ml。 必要的話，要進(jìn)行細(xì)胞最佳凍存密度測(cè)試。

 

Reference  

1. Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).

2.  Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.

3.  Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.

4. Data Acknowledgment: Prof. Shirley H.J. Mei and research team Yuan Tan and Mahmoud Salkhordeh, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hosptoal Research Institute(Ottawa, Canada).

 

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