前面我們介紹了熒光指示劑法可以將Ca2+檢測的實驗與其他技術(shù)結(jié)合使用，如可以與流式細胞儀、熒光分光光度計、或者熒光顯微鏡進行聯(lián)合檢測 。紫外光型主要包括Quin-2、Indo-1、Fura-2等，數(shù)量較少，可見光型數(shù)目較多，包括Fluo-3、鈣黃綠素、Rhod-2等。

熒光指示劑根據(jù)測光原理和數(shù)據(jù)處理的性質(zhì)又可以分為比值型和非比值型兩種類型。其中Fura-2、Benzothiaza、Indo-1和BTC等系列屬于比值型,化學熒光指示劑大都為非比值型染料。

雖然比值型熒光染料較少，但應用廣泛，下面介紹幾種典型的熒光染料的特點：Fura-2 屬于雙波長激發(fā)指示劑，其激發(fā)特性與Ca2+濃度有關(guān)，當介質(zhì)中沒有Ca2+時，其激發(fā)峰為380nm，當與鈣結(jié)合時，激發(fā)峰向短波方向340nm處移動，最后分別以340nm、380nm激發(fā),得到發(fā)射光的比例，這種比例與細胞內(nèi)Ca2+濃度成正比例的關(guān)系，這種染料可以減少染料負載，增強結(jié)果的準確性。Fura-2與雙波長顯微熒光分光光度計聯(lián)用可以測量單細胞內(nèi)Ca2+的濃度，與流式細胞儀聯(lián)用可以測定細胞懸液的Ca2+的濃度 ，與熒光分光光度計聯(lián)用測量單細胞內(nèi)及細胞懸液鈣離子的濃度，因為其結(jié)果準確，而且不易被漂白，所以是廣泛使用的指示劑。

Indo-1也是一種雙波長發(fā)射指示劑，單波長激發(fā)（340nm）和雙波長發(fā)射（405nm和506nm）,也可以用熒光比率來反應細胞內(nèi)Ca2+的濃度。它的優(yōu)點與Fura-2相似，但其漂白作用明顯，應用時應該盡量減小狹縫寬度和盡量減少激發(fā)光照射時間。 目前最新的熒光指示劑是第三代熒光指示劑Fluo-3,是典型的單波長指示劑，激發(fā)波長位于可見光范圍內(nèi)。最大吸收峰位于506 nm,最大發(fā)射波長是526 nm，F(xiàn)luo-3與Ca2+結(jié)合后其熒光強度比游離時高出40倍左右，從而避免了細胞自身的熒光干擾，作為長波長指示劑，F(xiàn)luo-3可以用作激光共聚焦成像研究，或者與其他熒光指示劑

Fura-2和Indo-1的熒光檢測

在適當?shù)臈l件下通過監(jiān)測比值型熒光指示劑的波長變化與細胞內(nèi)游離的Ca 2+濃度的變化關(guān)系來檢測Ca 2+濃度是一項出色的技術(shù)，我們可以通過觀察Fura-2在300 nm至400 nm之間的吸收位移來檢測鈣離子濃度（同時以約510 nm的固定發(fā)射波長）。同樣，Indo-1可以被流式細胞儀的氬離子激光器（〜350 nm）很好地激發(fā)，當與細胞內(nèi)游離的Ca2+結(jié)合時，Indo-1的發(fā)射波長從〜475 nm轉(zhuǎn)變?yōu)?#12316;400 nm。Fura-2和Indo-1的熒光發(fā)射的一個關(guān)鍵特征是分別在〜360 nm和〜460 nm處存在一個等位點（圖1）。此時，兩個比值型指示劑的熒光強度均對游離Ca 2+的濃度不敏感。另外，等位點的存在預示了正確的實驗室操作，因為其他離子的污染或錯誤的移液會導致等位點的缺少。

圖1. 在含有0-39μM游離Ca 2+的溶液中，F(xiàn)ura-2的熒光激發(fā)光譜（上）和Indo-1的發(fā)射光譜（下）。

Fura-2和Indo-1衍生物：

AM 酯：比值型指示器的活細胞加載
Fura-2和Indo-1比值型指示劑可以以AM酯形式用于活細胞上樣，用AM酯標記比值型指示劑有助于其在活細胞完整細胞膜上的被動擴散，一旦進入細胞，非特異性細胞內(nèi)酯酶就會水解AM酯，從而激活Ca 2+敏感指示劑。

Fura-2和Indo-1：鹽衍生物

Fura-2和Indo-1也可以作為細胞不滲透鹽衍生物使用以下方程式確定細胞質(zhì)中游離Ca 2+的濃度：

[Ca 2+ ] free  = K d [F-F min ] / [F max  -F]

公式中各字母代表：

• K d是指示劑的Ca 2+解離常數(shù)
• F是實驗水平下Ca 2+指示劑的熒光值
• F min是在不存在Ca 2+的情況下觀察到的指示劑的熒光值
• F max是Ca 2+飽和情況下指示劑的熒光值。

與校準溶液相比，比例指示劑與Ca 2+結(jié)合光譜性質(zhì)在不同細胞環(huán)境中差異很大。細胞內(nèi)指示劑的原位校準產(chǎn)生的K d值通常明顯高于體外測定的K d值，在離子載體存在下將加載的細胞暴露于已知濃度的Ca 2+緩沖液中進行原位校準，其中離子載體用于提高細胞內(nèi)Ca 2+的水平，在K d表1列出了一些鈣比例指標的值。

AAT Bioquest開發(fā)了Fura -8TM比值型指示劑，以AM酯和鹽衍生物形式提供，可改善對細胞內(nèi)鈣濃度的敏感響應。與Fura-2相比，F(xiàn)ura-8 TM具有更高的信噪比，同時保持了對Ca 2+的相似親和力（圖2）。Fura-8 TM的顯著優(yōu)點是其吸收和發(fā)射波長在紅色光譜方向上移動。Fura-8 TM可以在〜365 nm（與Ca 2+結(jié)合）和410 nm（無Ca 2 +）波長下激發(fā)，發(fā)射波長〜525 nm。這樣的光譜特性使Fura-8 TM可通過相對便宜的大功率LED激發(fā)，并與常見的發(fā)射濾波器組（例如FITC）兼容。此外，F(xiàn)ura-8 TM激發(fā)波長的變化使其可與在360 nm以下激發(fā)時會發(fā)出熒光的有機化合物一起使用，這可能導致錯誤信號。當使用Fura-8 TM時, 我們建議使用Ex / Em = 354/530 nm和415/530 nm進行比值測量。圖2.分別用Fura-2，AM（Cat＃21020）和Fura-8 TM，AM（Cat＃21055）測量的CHO-K1細胞中的ATP劑量反應。將CHO-K1細胞以40,000個細胞/ 100μL/孔在黑壁/透明底部96孔板中過夜接種。將細胞分別與Fura-2，AM或Fura-8，AM鈣測定染料上樣溶液孵育1小時。

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