時(shí)間分辨熒光：

理論上，熒光是最靈敏的檢測(cè)手段，由于許多分子間和分子內(nèi)的變化會(huì)改變標(biāo)記物的熒光發(fā)射。因此，很早就把它作為均相分析技術(shù)可能的新的手段。而現(xiàn)在偏振，淬滅，時(shí)間關(guān)聯(lián)，熒光壽命改變以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在對(duì)分子間作用的研究中。

在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質(zhì)是自發(fā)熒光的，利用傳統(tǒng)的快速熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)極大的限制了實(shí)驗(yàn)靈敏度。使用長(zhǎng)壽命的熒光基團(tuán)結(jié)合時(shí)間分辨的檢測(cè)方式（在熒光激發(fā)和發(fā)射檢測(cè)之間有一個(gè)時(shí)間延遲）可將快速熒光的干擾降到最低。

時(shí)間分辨熒光（TRF）利用稀土元素中鑭系元素的獨(dú)特性質(zhì)。再TRF中常用的鑭系元素是釤（Sm）、銪（Eu）、鋱（Tb）、鏑（Dy）。與傳統(tǒng)熒光基團(tuán)相比，他們具有大的斯托克位移，和非常長(zhǎng)的發(fā)射半衰期（從微妙到毫秒），這使它們?cè)谏�物學(xué)熒光應(yīng)用領(lǐng)域中日益重要。

通過(guò)直接激發(fā)使鑭系元素離子產(chǎn)生熒光是不容易的，因?yàn)檫@些離子很難吸收光子，鑭系元素必須首先與有機(jī)分子形成復(fù)合物，有機(jī)分子收集光子并通過(guò)分子內(nèi)非放射性過(guò)程轉(zhuǎn)移到鑭系元素上。稀土元素螯合物和穴狀配合物是能量收集裝置的典型代表，他們收集能量并轉(zhuǎn)移到鑭系元素離子上，后者則發(fā)出其特征性的長(zhǎng)壽命熒光。

為了能夠成功應(yīng)用于生物學(xué)檢測(cè)中，稀土元素復(fù)合物應(yīng)該具有特定的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性。較高的發(fā)射光產(chǎn)率，并且能夠與生物分子進(jìn)行連接。除此之外，當(dāng)直接在生物溶液中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，能夠耐受熒光淬滅就顯得尤為重要。稀土元素螯合物穩(wěn)定性較差，而且有的化合物可競(jìng)爭(zhēng)螯合物活性基團(tuán)，當(dāng)與FRET技術(shù)結(jié)合在一起時(shí)其靈敏度也會(huì)收到限制。如果稀土元素與穴狀物結(jié)合，許多限制因素都可去除。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：

熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)(供體 Donor)的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)(受體 Acceptor)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)(一般小于100Å)，就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，可觀察到后一個(gè)基團(tuán)發(fā)射的熒光。

在熒光共振能量轉(zhuǎn)移中，受體發(fā)射熒光的壽命等同于供體的發(fā)射熒光的壽命。因?yàn)镋u的熒光衰減周期較長(zhǎng)，所以含Eu的供體會(huì)誘導(dǎo)XL665受體長(zhǎng)時(shí)間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，這樣通過(guò)時(shí)間分辨就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號(hào)。

當(dāng)由于生物分子相互作用導(dǎo)致兩個(gè)熒光基團(tuán)接近時(shí)，在激發(fā)時(shí)被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm；另一部分能量轉(zhuǎn)移到受體（acceptor）上，發(fā)射波長(zhǎng)為 665nm。665nm的發(fā)射光僅僅由供體（donor）引起的FRET產(chǎn)生。所以，當(dāng)生物分子相互作用時(shí)，有兩個(gè)激發(fā)光620nm和 665nm；當(dāng)不存在相互作用時(shí)，只有620nm一個(gè)激發(fā)光。

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3.比其他TRF染料更容易與生物分子偶聯(lián)，具有更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。

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使用trFluor 標(biāo)記的鏈霉親和素偶聯(lián)物進(jìn)行TR-FRET測(cè)定原理

時(shí)間分辨發(fā)光探針的典型受體： 

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