原代細(xì)胞相對(duì)普通傳代細(xì)胞要難轉(zhuǎn)染，但用對(duì)了試劑一樣可以擁有很高的轉(zhuǎn)染效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下面以RFect為例，簡(jiǎn)單介紹下原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染的操作步驟和注意事項(xiàng)。

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：
A. 細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，每孔500 μl培養(yǎng)基（不可加抗生素），使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)密度在30-50%。
B. siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備：
1.6pmol siRNA 用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。
2.2μl RFectPM用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25 min內(nèi)執(zhí)行第三步操作，不要過(guò)于延遲。
3.孵育5min后，將siRNA 稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20 min。
C. 將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：
1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，混勻。
2.37°C培養(yǎng)18-72h，檢測(cè)基因抑制效果。如果需要，細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時(shí)可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。孵育時(shí)間的長(zhǎng)短，取決于細(xì)胞類(lèi)型、
所干擾基因本身及分析方法�？稍O(shè)置不同的孵育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定最佳孵育時(shí)間。
轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)優(yōu)化: 為了提高轉(zhuǎn)染效率，最好對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，特別是首次使用。例如：24孔培養(yǎng)板，調(diào)整 siRNA與RFectPM試劑的用量。siRNA用量在0.6-30 pmol (final concentration 1- 50 nM)之間調(diào)整，RFectPM試劑用量在1.0 - 3.0μl之間調(diào)整。

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：
轉(zhuǎn)染過(guò)程不可添加抗生素，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；
首次實(shí)驗(yàn)siRNA的用量設(shè)置在終濃度10nM、30nM、50nM、100 nM進(jìn)行摸索 ，后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果修改。

RFectPM可用來(lái)轉(zhuǎn)染siRNA、antisense RNA、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。對(duì)于大多數(shù)原代細(xì)胞，RFectPM的細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率都在80%以上，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡(jiǎn)便，先將sRNA與RFectPM室溫混合，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效果沒(méi)有影響，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液。

使用RFect 系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1.細(xì)胞接種：一般做轉(zhuǎn)染前一天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml），使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%；如果細(xì)胞是原代細(xì)胞，接種密度可以密一些，細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml；懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml），待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。
2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果，第一次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將最佳轉(zhuǎn)染條件（siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例）放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可。
3.設(shè)置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個(gè)梯度，每個(gè)梯度最好做2-3個(gè)復(fù)孔（至少2個(gè)復(fù)孔，避免實(shí)驗(yàn)誤差）。
4.用來(lái)稀釋siRNA和稀釋轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無(wú)血清培養(yǎng)基，因?yàn)檠�清的存在�?huì)干擾siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合，并且影響轉(zhuǎn)染效率。
5.檢測(cè)方法：轉(zhuǎn)染后48h收細(xì)胞做qPCR基因水平檢測(cè)或者轉(zhuǎn)染后72h收細(xì)胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測(cè)。

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