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第二課

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中不可或缺的除了培養(yǎng)基，胰酶也是非常重要的一個(gè)角色，雖然細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)基本技術(shù)大同小異，每種細(xì)胞的培養(yǎng)條件各不相同，但是，在細(xì)胞傳代過程中都少不了這個(gè)步驟—胰酶消化。

細(xì)胞消化使用胰酶時(shí)需要了解哪些問題？
 

一、 細(xì)胞培養(yǎng)過程中為什么要使用胰酶呢？胰酶的作用是什么？
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點(diǎn)是肽鏈的Lys或Arg兩個(gè)殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞膜上與培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時(shí)，細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力可成為球形。
 

圖1.胰酶酶切位點(diǎn)

二、 使用胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，在使用胰酶消化時(shí)發(fā)現(xiàn)血清可以終止此過程，這是何原因？

血清終止的原理其實(shí)是競爭抑制，就是用過量的牛血清中含有的蛋白和胰酶結(jié)合，使胰酶失去消化細(xì)胞蛋白的機(jī)會。

三、 為什么使用了胰蛋白酶消化，細(xì)胞還是成團(tuán)的，這可能是什么原因?qū)е碌模?/p>

① 消化時(shí)間不夠 ② 吹打力度不夠 ③ 胰酶消化液濃度不夠 ④ 細(xì)胞密度過高之后才消化傳代 ⑤ 胰酶存儲不當(dāng)，或者使用了過期胰酶

四、 胰酶分裝凍存時(shí)要注意什么？

胰酶分裝時(shí)盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因?yàn)槔鋬霰４鏁r(shí)體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會降低消化效果并增大污染的可能性。

五、 怎么才能判斷胰酶消化完全？

注意：不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才表示消化好了。

一般肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，就應(yīng)該停止消化。

六、 胰酶適用于哪些細(xì)胞消化？它的消化效果與哪些有關(guān)呢？

胰酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織和傳代細(xì)胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶的消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關(guān)。

七、 胰酶中的酚紅有哪些作用？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH指示劑，中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明：酚紅可以模擬固醇類激素（特別是雌激素）的作用。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，建議用不含酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，也會使用不含酚紅的培養(yǎng)基或者胰酶。

圖 2. Phenol red test

八、 在做細(xì)胞凋亡檢測時(shí)，細(xì)胞為什么不能用含有EDTA的胰酶消化？

Annexin V（膜聯(lián)蛋白）是Ca2+依賴的蛋白，EDTA會螯合Ca2+從而影響Annexin V，進(jìn)而影響結(jié)果，因此需選用不含EDTA的胰酶。建議放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，時(shí)間可以長一點(diǎn)。隨時(shí)觀察細(xì)胞情況，避免消化過度；也可使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，后用槍吹勻，比消化簡單，還可避免使用胰酶帶來的傷害。
 

本期講堂到這里就結(jié)束啦

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