質(zhì)粒提取的方法和影響因素

瀏覽次數(shù)：6331　發(fā)布日期：2019-10-31　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

質(zhì)粒提取，您真的了解它嗎？

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或者表達(dá)的重要媒介，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)最常見的實(shí)驗(yàn)之一。目前質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)大多借助試劑盒來完成，那么關(guān)于質(zhì)粒提取的原理，您的了解足夠深入嗎？

目前，質(zhì)粒提取試劑盒最常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強(qiáng)堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物。這樣，通過離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，再采用吸附柱對質(zhì)粒進(jìn)行吸附、去雜質(zhì)、洗脫，就完成了質(zhì)粒提取的實(shí)驗(yàn)。

在進(jìn)行質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)室，有時(shí)候質(zhì)粒提取的濃度不高，達(dá)不到后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面跟隨星博士一起來看一下質(zhì)粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案調(diào)整，從而得到更高濃度的質(zhì)粒樣本啦！

影響質(zhì)粒提取的因素：

質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)�？截悢�(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素等。

宿主菌的種類和培養(yǎng)條件

多數(shù)情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖類，如果沒有完全去除，將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。

由于無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。因此，宿主菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過程中，務(wù)必加入抗生素進(jìn)行篩選。宿主菌接種到含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，不應(yīng)超過16小時(shí)。超過16小時(shí)后，細(xì)胞開始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。

不同質(zhì)粒間的差異

質(zhì)粒提取最終的濃度，最重要的影響因素之一就是質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)�？截悢�(shù)是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目，每個(gè)細(xì)菌中的質(zhì)粒的拷貝數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。

按照復(fù)制機(jī)制，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)菌內(nèi)只含1-2個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)菌內(nèi)一般含20個(gè)左右質(zhì)�？截�，這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質(zhì)粒與低拷貝質(zhì)粒在相同條件下進(jìn)行質(zhì)粒提取，高拷貝質(zhì)粒濃度會高于低拷貝質(zhì)粒的濃度。不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。

在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。因?yàn)槁让顾啬芤种扑拗骷?xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒有影響。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長，故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質(zhì)粒提取的濃度。

質(zhì)粒鑒定與評價(jià)：

瓊脂糖電泳檢測：

堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，理想狀況是只出現(xiàn)超螺旋—條帶，但在質(zhì)粒提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等原因，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體(即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒粘連在—起)。

如果加溶液Ⅱ后過度振蕩，會在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷，因此要注意加完P(guān)2、P3后輕柔混勻。質(zhì)粒提取是否有基因組污染，可以進(jìn)行單酶切驗(yàn)證，酶切后有單一條帶，就證明質(zhì)粒提取的產(chǎn)物是單一的。

濃度及純度測定：

用紫外線分光光度計(jì)檢測濃度測定標(biāo)準(zhǔn)為：OD 260 值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。

【AD0102】

泳道 1：Spark 10000 DNA Marker

泳道 2-4：提取后的 pUC19 質(zhì)粒 (2.6kb)

泳道 5-7: 提取后的 Hyg 102(10.2kb)

泳道 8-10：提取后的 pShuttle-CMV 質(zhì)粒 (7.5kb)

泳道 11-13：提取后的 plentiCRISPR V2 質(zhì)粒 (14.8kb)

質(zhì)粒提取試劑盒實(shí)際驗(yàn)證效果（AD0102）如上圖所示。無需柱平衡，30min內(nèi)可完成多個(gè)樣本的質(zhì)粒抽提。針對不同提取量，思科捷推出小提、中提、大提的試劑盒，可滿足大腸桿菌、酵母等不同菌株的質(zhì)粒提取需求。若后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒所得的質(zhì)粒，能夠滿足您進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的要求。

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