提到多能干細胞（PSC）培養(yǎng)，
經(jīng)常會遇到諸如此類不省心的事兒
。。。。

那么關于PSC傳代培養(yǎng)、凍存、復蘇
及基質(zhì)使用
都有什么技巧和要點？
這次我們繼續(xù)就廣大用戶遇到的困難，
用心總結
快把你們的眼神轉過來！
自由選擇板凳，沙發(fā)，還是躺床上漲姿勢
此外若仍有疑問，歡迎大家積極發(fā)言�。�！
（可在文章下方留言或私信）

     無血清培養(yǎng)基    

PSC培養(yǎng)通常推薦使用無血清培養(yǎng)基，
比如，BI NutriStem® hPSC無血清培養(yǎng)基。
支持hESC及iPSC快速貼壁并大量增殖，bFGF和TGFβ因子濃度更低，不干擾細胞代謝，不刺激細胞分化。
并且適用于臨床，已獲得美國FDA二類原料藥證號，DMF NO：30984 

    hPSC傳代     

何時開始傳代培養(yǎng)？
1. 滋養(yǎng)層細胞老化
2. 細胞集落太密或細胞停滯增長
3. 細胞集落已經(jīng)有合并的現(xiàn)象
4. 細胞集落開始堆積或分化

完全培養(yǎng)基的準備
1. 凍存的 NutriStem^®  hPSC XF在室溫或2-8℃解凍，避免反復凍融，解凍的培養(yǎng)基可以存儲2-8°C，2周內(nèi)使用完畢。
2. 如果需要較小的數(shù)量，以無菌技術配制成等份，避免反復凍融。
3. NutriStem^® hPSC XF使用前必須回溫至15°C-30°C，為確保培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，只需回溫所需的量，貯藏時避免照光。

如何做好傳代培養(yǎng)？
1. 以6孔板滋養(yǎng)層培養(yǎng)為例，吸除孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入1.0 ml膠原酶溶液。
2. 放置在37°C或室溫，直到細胞集落從孔板的邊緣開始松動（孵育的時間，在細胞株和細胞聚落大小之間會有所不同）。一般孵育3分鐘后開始檢查細胞集落，勿孵育時間過長，hPSC細胞對膠原酶比較敏感，容易從孔板脫落。
3. 吸去分離液，用2ml無菌培養(yǎng)基DMEM/F-12 (1:1)輕洗兩次。
4. 加入1ml培養(yǎng)基，用5ml移液管輕輕將脫落hPSC細胞從孔板內(nèi)吹打下來，謹慎吸出上清至離心管，不要吸到滋養(yǎng)層細胞。
5. 在室溫以800rpm離心3~5min。
6. 吸除上清，加入NutriStem^®  hPSC XF培養(yǎng)基，用5ml移液管輕輕將細胞團打散，將細胞接種至有滋養(yǎng)層細胞孔板中，加入2.5~3.0ml NutriStem^® hPSC XF培養(yǎng)基，放入37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7.每天更換一次2.5~3.0ml新的NutriStem^® hPSC XF培養(yǎng)基

關于細胞傳代比例
保持細胞的傳代比率很重要，
生長較慢的細胞按1：4傳代，生長較快的按1：8傳代

    基質(zhì)的使用   

無滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)，建議使用層粘連蛋白LN521。
在LN521上，hPSCs細胞以單細胞形式接種，生長成為均質(zhì)的單細胞層，無自然分化，也無須使用凋亡抑制劑。
細胞約在4至6天內(nèi)達到融合，并擴增10至25倍
周末也無須進行換液

層粘連蛋白包被
層粘連蛋白涂層包被，包被濃度0.5-1μg/cm²
（一般包被 0.5μg/cm²），以下以6孔板為例：

1. 在2-8°C緩緩解凍層粘連蛋白（重組LN521）。
2. 用含鈣鎂的DPBS稀釋LN521至5ug/ml
3. 每孔加入2ml稀釋好的LN521。
4. 密封培養(yǎng)器皿（如使用parafilm^® 膜）防止蒸發(fā)，在2-8°C孵育過夜，確保層粘連蛋白溶液均勻分布在表面。避免表面干燥，以免層粘連蛋白失活。

在LN521上培養(yǎng)hPSC細胞
1. 以6孔板滋養(yǎng)層培養(yǎng)為例，每孔加入適量DPBS （2ml/well 不含鈣離子和鎂離子)輕輕沖洗1次，每孔加入1.0ml重組胰酶-EDTA，覆蓋整個細胞表面，在37°C 作用 2~4min(勿在EDTA孵育時間過長)。
2. 加入4.0ml的1xSBTI ，中和重組胰酶-EDTA，并將細胞吹打下來。謹慎收集細胞懸液到離心管中, 200xg離心5min。
3. 離心后，棄上清液，用1.0ml完全培養(yǎng)基懸浮后，混勻細胞懸液。臺盼藍1:1混勻，計數(shù)細胞。
4. 將細胞接種至層粘連蛋白包被培養(yǎng)器皿中，加入3.0-4.0 ml培養(yǎng)基，10-20,000 /cm²細胞密度，培養(yǎng)約4-5天。
5. 在37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時內(nèi)不要移動孔板(會促進分裂后細胞分化）。每天更換一次新的NutriStem^® hPSC XF培養(yǎng)基，2.5~3.0ml。48小時后達到最佳培養(yǎng)密度，4-6天后，大多數(shù)細胞達到倍增10-25倍。

關于細胞凍存和復蘇，
我們已經(jīng)總結過，
BI教您如何做好細胞凍存與復蘇？
看過的童鞋可以再復習一遍，
看看是否真正掌握！
 

若是貼壁細胞，請先將細胞消化下來；若是懸浮細胞，請直接按以下步驟進行：
1. 以200-300g離心3分鐘，棄去上清，收集細胞。
2. 用BI無血清凍存液將細胞重懸（不需回溫），將細胞密度調(diào)整為3~5x10⁶cells/ml，添加到凍存管中（一般每管1ml）。
3. 建議將含有細胞懸液的凍存管放進程序降溫盒或是保溫杯中，置于-80°C冰箱6小時以上或是過夜（或不需要程序降溫)。
4. 將凍存管迅速移到液罐氮中保存。
5. 凍存24小時后，建議檢測細胞存活率。

細胞復蘇
1. 將細胞凍存管由液罐氮中取出，置于室溫回溫，不用水浴溶解。此時可準備新鮮培養(yǎng)   基、無菌15ml離心管、培養(yǎng)瓶等。
2. 在生物安全柜內(nèi)，直接以少量培養(yǎng)基反復沖融，使細胞團塊化凍。
3. 先在15ml無菌離心管中加入5ml培養(yǎng)基，再將化凍的細胞懸液加入離心管中。以200~300g，3分鐘離心收集細胞。
4. 倒去上清液，重懸細胞，移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

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