NADP蘋果酸酶（Malic enzyme  ，NADP-ME）試劑盒-說明書

 
分光光度法 50 管/48 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：
ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和 CO₂，以及伴隨 NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物 ME 活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將 ME 分為 NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測(cè)定原理：
NADP-ME 催化NADP⁺還原成 NADPH，在 340nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。；
試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存； 臨用前加入 50mL 試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20
度保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 850μL 試劑二，混勻，30℃孵育 5min，加入 100μL 試劑三， 混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。
NADP-ME 活性計(jì)算：

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

1. 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =3215×ΔA÷W

1. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：