微生物樣品的處理方法
一、初級（初始）樣品混懸液
樣品通過稱取一定重量后或量取一定體積后，加入9倍重量或體積的特定稀釋液，經(jīng)過外力作用充分均質(zhì)混勻后，得到懸濁液、溶液或者乳濁液。
有的初始混懸液中含有較大的樣品顆粒時，應(yīng)將其水平靜置沉淀。這樣得到的是初級(初始)混懸液(10-1)。
二、次級十倍梯度稀釋
取一特定體積的初級混懸液，加入9倍特定體積的稀釋液充分混勻，這樣就將初級混懸液進(jìn)行了十倍稀釋操作(10-2),然后依次再進(jìn)行下去(10-3，10-4....10-n),得到一系列的稀釋液，直至得到滿足目標(biāo)微生物培養(yǎng)要求的稀釋液。這樣的操作叫次級十倍梯度稀釋，得到的一系列稀釋液被統(tǒng)稱為次級十倍梯度稀釋液。
三、稀釋操作的原則
初級混懸液的制備是為了讓樣品中的微生物盡可能均勻分布，然后在接下來的次級十倍梯度稀釋液中，微生物的數(shù)量能按指數(shù)進(jìn)行均勻規(guī)則的遞減，這樣通過培養(yǎng)之后，方便用于菌落計數(shù)操作。
為了嚴(yán)格每一個稀釋度的計數(shù)范圍，提高計數(shù)的準(zhǔn)確性，應(yīng)先對樣品的微生物污染程度做一次大體的評估，然后至少選取合適的兩個連續(xù)稀釋度的稀釋液，每個稀釋度至少接種兩個培養(yǎng)基平板進(jìn)行培養(yǎng)。無論是初級樣品混懸液還是次級十倍梯度稀釋樣品溶液，都應(yīng)振蕩均勻，保證其微生物在溶液中均勻分布之后再進(jìn)行接下來的操作。
振蕩時應(yīng)該在渦旋混和器上進(jìn)行(見圖)。用右手拇指和中指夾緊試管，右手食指抵住試管帽，防止振動時試管帽飛出，三個手指用力將試管底部頂住渦旋混和器的橡膠振動頭上。渦旋混和器運轉(zhuǎn)時通常有兩檔：一個是振動頭持續(xù)振動，一個是只有物品頂住振動頭才會振動，通常選用后者。如果沒有渦旋混和器，可以采用手心振動混勻的方法。
四、稀釋液
⒈配制稀釋液的通常原則
為了使結(jié)果更具可重復(fù)性，建議配制稀釋液時，無論用脫水的單種試劑逐一稱量配制還是使用脫水的商業(yè)成品培養(yǎng)基，實驗室人員在配制稀釋液時必須嚴(yán)格按照以下原則：
(1)配制稀釋液的各種試劑或脫水成品培養(yǎng)基干粉一定要保證質(zhì)量。
(2)配制稀釋液的水必須是合格的蒸餾水，水的各項指標(biāo)(pH、水活度、電導(dǎo)率、電阻率、菌落總數(shù))必須符合培養(yǎng)基配制用水的要求。
(3)稀釋液各組分必須充分溶解形成均一溶液，無沉淀。稀釋液配好之后， pH要滿足目標(biāo)微生物的存活要求，特別是稀釋液經(jīng)高壓滅菌之后的pH, pH誤差的正常范圍應(yīng)在±0. 2 (25 ℃時)。
⒉普通稀釋液
常用的普通稀釋液有濃度為0.1%、 pH6.8~7的滅菌蛋白胨水(按蛋白胨1.0g,氯化鈉8.5g,蒸餾水1000 mL的比例混和至完全溶解),磷酸鹽緩沖液， 0.85%的氯化鈉溶液， 2%的緩沖蛋白胨水等。有時會因具體情況加入一些添加劑，例如對于脂肪含量高的樣品會加入乳化劑、表面活性劑；對于均質(zhì)操作時容易起泡沫的樣品會加入泡沫抑制劑、消泡劑等。
在制備初級樣品溶液時，由于樣品的含量占整個溶液系統(tǒng)的比例較大，樣品可能會改變稀釋液的性質(zhì)，特別當(dāng)樣品中難溶于水的物質(zhì)占較大比例時，樣品在稀釋液中的溶解度會受到影響。此時會影響到溶液的pH或者水活度(Aw),所以當(dāng)無法確定樣品是否對稀釋液產(chǎn)生這種影響時，應(yīng)測定第一個稀釋度的pH和水活度。可以在稀釋液中加入磷酸鹽緩沖液來穩(wěn)定pH的變化。
特別注意的是，對于一些高溶解度的干燥樣品(奶粉、嬰兒食品)制成初級樣品溶液時，水活度非常低，所以應(yīng)選擇蒸餾水作為稀釋液。針對不同樣品，選擇最適合的稀釋液，這其實需要通過一系列的試驗得到，所選擇的稀釋液應(yīng)該具有高的復(fù)蘇率。
樣品的稀釋液制備過程，應(yīng)該在30 min內(nèi)完成。
⒊針對厭氧微生物的稀釋液
對食品中厭氧微生物進(jìn)行定性或定量檢測時，必須把氧化作用降到最低，稀釋液應(yīng)具有抗氧化作用。制備樣品溶液時，應(yīng)盡量避免氧氣進(jìn)入。檢測對氧氣極其敏感的厭氧菌時，除了使用適當(dāng)?shù)南♂屢和猓�還要具備一些特殊設(shè)備作為輔助，比如用厭氧工作站來作為菌體的防護(hù)措施來操作。
⒋中和類稀釋液
有些樣品中含有抑菌物質(zhì)、消毒劑等殺滅或抑制微生物的成分。需要加入某些有機(jī)或無機(jī)化合物與這些成分作用進(jìn)行中和，消除其影響。
對于醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養(yǎng)肉湯即可；對于含氯消毒劑、含碘消毒劑、過氧化物消毒劑，需在稀釋液中加入0.1%硫代硫酸鈉；對于洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在稀釋液中加入3% (質(zhì)量濃度)吐溫-80和0.3%卵磷脂；對于醛類消毒劑，需在稀釋液中加入0.3%甘氨酸；對于含有表面活性劑的各種復(fù)方消毒劑，需在稀釋液中加入3% (質(zhì)量濃度)吐溫-80,以中和被檢樣液的殘效作用；
針對大蒜泥、大蒜粒、大蒜粉、洋蔥粒等這類樣品，由于樣品中會含有抑制細(xì)菌生長的成分，可以采用D/E中和肉湯。
⒌嗜鹽菌、嗜滲菌稀釋液
研究嗜鹽菌(如：食鹽樣品),應(yīng)采用15%的無菌氯化鈉溶液作為稀釋液。嗜滲菌計數(shù)時，可以用20%的無菌蔗糖溶液作為稀釋液，這樣做的目的是為了保護(hù)菌體，因為普通的稀釋液對于這類菌來說，由于液體滲透壓過大，菌體會因液體的滲透作用膨脹破裂，導(dǎo)致菌體死亡無法進(jìn)行培養(yǎng)和計數(shù)。這就需要與之相適應(yīng)的無菌高滲溶液作為稀釋液，避免因滲透作用導(dǎo)致菌體死亡。
五、稀釋液的分裝和滅菌
將稀釋液分裝至適宜制備初級混懸液的容器內(nèi)，容器體積應(yīng)大小合適，不能太小，防止高壓滅菌時液體溢出。
將稀釋液分裝至進(jìn)行十倍梯度稀釋的試管內(nèi)，一般每支試管裝9mL稀釋液，滅菌之后，每支試管內(nèi)的稀釋液體積變化應(yīng)在±2%以內(nèi)。
對某些微生物計數(shù)時，會用到一些不同的培養(yǎng)基，或許在分裝用于這些微生物的稀釋液(或其中一部分稀釋液)的體積遠(yuǎn)大于9ml,這種情況下，裝這些稀釋液的試管或燒瓶應(yīng)按實際的裝液量進(jìn)行合理選擇。
將裝好稀釋液的燒瓶或試管用配套的塞子塞好。一般稀釋液的高壓滅菌條件是121℃，15 min,
應(yīng)特別注意滅菌前后稀釋液的pH變化，某些稀釋液或培養(yǎng)基在滅菌之后， pH會降低。因為pH的變化對目標(biāo)微生物的生物活性會造成影響，同時也是人工操作中很容易被忽視的一個環(huán)節(jié)，除了使用精度pH試紙以外，最好能配備一臺pH電子測量計，誤差為±0.1個pH單位之內(nèi)。
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