【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)定量檢測試劑盒（ELISA）

英文名稱：Rat  hepatocyte growth factor(HGF)ELISA KIT

【預(yù)期用途】

僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)的濃度。

【檢驗原理】

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預(yù)包被抗大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)抗體（固相抗體，貨號：INS102027C）的微孔酶標(biāo)板中，加入大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：INS102027J）、待測樣本和生物素化的檢測抗體（貨號：INS102027K）。經(jīng)過孵育，樣本中存在的 HGF與固相抗體和檢測抗體結(jié)合。經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合的組分，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(streptavidin-HRP)，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。洗滌后，加入顯色底物 TMB，避光顯色。底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色。在酶標(biāo)儀上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)的濃度正相關(guān)。擬合標(biāo)準(zhǔn)品曲線，可以計算出樣本中大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)的濃度。

【主要組成成分】

主要成分

組分	48T規(guī)格	96T規(guī)格
標(biāo)準(zhǔn)品	1 vial	2 vial
預(yù)包被酶標(biāo)板	96T	48T
檢測抗體	1 vial	1 vial
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	5 ml	5 ml
HRP標(biāo)記的鏈霉親和素	1vial	1vial
10×檢測緩沖液	5 ml	5 ml
顯色底物 TMB	10 ml	10 ml
終止液	10 ml	10 ml
20×濃縮洗滌液	30mL	30mL
說明書	1份	1份
自封袋	1個	1個
封板膜	3片	3片

 

需要但未提供的材料及耗材

1、能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長 570 nm 或 630 nm。

2、精密移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水或去離子水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、1L量筒

7、無粉一次性乳膠手套

8、稀釋用聚丙烯試管

【儲存條件及有效期】

1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。

2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

3、開封后，按照建議的條件保存，校準(zhǔn)品、包被微孔板和HRP標(biāo)記抗體，有效期為28天，其他成分在標(biāo)簽標(biāo)明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

  半自動的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3，或者國產(chǎn)酶標(biāo)儀。

【樣本要求】

  樣本類型和采集

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。

2、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。

3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【試劑準(zhǔn)備】

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫。

如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水或去離子水至 1000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。

轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 - 25℃貯存，1×洗液可穩(wěn)定 30 天。

1×檢測緩沖液

吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水或去離子水至 50 ml，輕輕混勻，避免泡沫。

2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖液可穩(wěn)定保存 30 天。

檢測抗體

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢測抗體。

注意：請在 30 分鐘內(nèi)使用稀釋后的檢測抗體。

辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素

稀釋前充分混勻。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。

注意：請在 30 分鐘內(nèi)使用稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。

樣本稀釋

如果樣本需要稀釋，請用試劑盒提供的 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清

大鼠HGF標(biāo)準(zhǔn)品

用蒸餾水或去離子水重溶大鼠HGF標(biāo)準(zhǔn)品，重溶體積標(biāo)注在大鼠 HGF 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 4000 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋前充分混勻。

請使用聚丙烯管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。

血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

取 200μl 濃縮的大鼠 HGF 標(biāo)準(zhǔn)品，加入 200 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度 (2000 pg/ml)。在每一個試管中加入200 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

取200μl濃縮的人大鼠 HGF標(biāo)準(zhǔn)品，加入 200 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度 (2000 pg/ml)。在每一個試管中加入 200 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，確保充分混勻。以細(xì)胞培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

4000 pg/ml     

操作程序

1、所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法配置好，并建議做復(fù)孔。

2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

3.加入 350 μl 1×洗液靜置浸泡25 秒。為了獲得理想的實驗結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后， 在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

4.每孔加入 50 μl 1×檢測緩沖液（本步驟某些指標(biāo)的產(chǎn)品可能有所改動）。

5.復(fù)孔加入 50 μl 2 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔復(fù)孔加入 50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。樣本孔加入 50 μl樣本（本步驟某些指標(biāo)的產(chǎn)品可能有所改動）。

6.每孔加入 50 μl 稀釋的檢測抗體。保證步驟 4、5、6 連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在 10 分鐘內(nèi)完成。

7.使用封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育 2 小時。

8.棄掉液體，每孔加入 350 μl 洗液洗板，洗滌 5 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。

9.每孔加入 100 μl 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。

10.使用新的封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育 45 分鐘。

11.重復(fù)步驟 8。

12.每孔加入 100 μl 顯色底物 TMB，避光，室溫孵育 5 - 30 分鐘。

13.每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。

14.在 15分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定 450 nm 最大吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長下的 OD 值。校準(zhǔn)后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導(dǎo)致 OD 值偏高，并且準(zhǔn)確度降低

【檢驗結(jié)果的解釋】

計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均 OD 值，然后減去零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值。

檢測完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計算機軟件，回歸分析確定最佳擬合曲線，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度                  

【檢驗方法的局限性】

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度，請用檢測緩沖液稀釋樣本，并重新檢測。如果細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本需要較大的稀釋倍數(shù)，請用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行適度稀釋。

6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果，檢測前，請排除該因素。

7、通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

4、靈敏度

最低檢出劑量小于12.5pg/ml。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次回收率評估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)，與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。

7、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，有效期6個月。

【注意事項】

生物安全

1、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護(hù)手套，實驗完成后徹底洗手。

4、試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護(hù)服，及防護(hù)眼睛、手及面部的設(shè)施。

5、本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療。

6、請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒中的試劑。

技術(shù)要點

1、重溶或者混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加標(biāo)準(zhǔn)品與樣本時，每個標(biāo)準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

廢物處理

所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序，每個實驗室都有責(zé)任根據(jù)其實驗的類型和危險性級別，進(jìn)行廢物和污物的處理，同時要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對待所有的廢物和污物。