蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào):YJ1270 規(guī)格:50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
紫外分光光度法
試劑一:粉劑 0.1g×3 支,4℃保存。(使用前根據(jù)樣品數(shù),每支加 1mL 水溶解,每支為 10 個(gè)樣品用量)
試劑二:液體 10mL×1 瓶,4℃避光保存。試劑三:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
試劑五:根據(jù)測(cè)定樣品量,將乙酸乙酯和無(wú)水乙醇等體積混合。(自備) 試劑六:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
產(chǎn)品說(shuō)明:
蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過(guò)程中的早期標(biāo)志,其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小,是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標(biāo)。
羰基與 2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成紅色 2,4-二硝基苯腙,在 370nm 處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、漩渦震蕩儀、紫外分光光度計(jì)、1 mL 石英比色皿、蒸餾水, 無(wú)水乙醇和乙酸乙酯。
操作步驟:
一、樣品處理
組織樣品:稱取約 0.1g 組織樣品,加入 1mL 提取液,充分勻漿后于 4℃,5000rpm 離心 10min, 取上清,加入 0.1mL 試劑一,室溫放置 10min,4℃,12000rpm 離心 10min,取上清,然后取 20μL 測(cè)定蛋白含量,剩余的作為待測(cè)樣品。
二、測(cè)定步驟和操作表
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空白管 |
測(cè)定管 |
樣品(mL) |
0.2 |
0.2 |
試劑二(mL) |
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0.4 |
試劑三(mL) |
0.4 |
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混勻,37℃避光反應(yīng) 1h | ||
試劑四(mL) |
0.5 |
0.5 |
靜置 5min,4℃,12000rpm 離心 15min,棄上清,留沉淀 | ||
試劑五(mL) |
1.0 |
1.0 |
漩渦混勻,4℃,12000rpm 離心 10min,棄上清,留沉淀。重復(fù) 3 次 | ||
試劑六(mL) |
1.0 |
1.0 |
漩渦混勻,37℃溫育 15min,沉淀全部溶解后,4℃,12000rpm 離心 15min,取 上清 1mL 于石英比色皿,試劑六調(diào)零,測(cè)定 OD370 |
三、計(jì)算公式
1、按蛋白濃度計(jì)算:
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mg prot)=(OD370 測(cè)定管-OD370 空白管)÷(ε×d)×V÷(Cpr×V 樣品)
=(OD370 測(cè)定管-OD370 空白管)÷4.4÷Cpr;
2、按樣本鮮重計(jì)算:
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/g 鮮重)=(OD370 測(cè)定管-OD370 空白管)÷(ε×d)×V÷(W×V 樣品÷V 提取)
=(OD370 測(cè)定管-OD370 空白管)÷4÷W
ε:蛋白質(zhì)羰基消光系數(shù),22 mL•μmol-1•cm-1;d:比色皿光徑,1cm;V:加入試劑六體積,1mL;
V 樣品:加入樣本體積,0.2 mL; V 提。杭尤胩崛∫杭霸噭┮惑w積,1.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。W:樣品質(zhì)量,g。
注意事項(xiàng):
1. 試劑一使用之前根據(jù)要測(cè)定的樣品數(shù)現(xiàn)配,配置好后 4℃保存,若變?yōu)楹谏瑒t不能使用。
2. 試劑二見(jiàn)光易分解,反應(yīng)需嚴(yán)格避光。