Alexandra Scholz (alexandra.scholz@sartorius.com)
Stephanie Schweizer (stephanie.schweizer@sartorius.com)

引言

作為世界上最小的細(xì)菌之一，支原體能夠獨立繁殖。它們屬于柔膜菌綱，生長非常緩慢，且為寄生。細(xì)胞培養(yǎng)物的污染仍是一個主要問題。一系列生理和生化參數(shù)受細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體的影響。支原體感染會導(dǎo)致細(xì)胞的代謝、生長、活力、大分子合成、形態(tài)等發(fā)生變化，因此對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行靈敏的常規(guī)污染檢測是必不可少的。

傳統(tǒng)的基于生長的方法需要培養(yǎng)至少28天才能確定地排除支原體污染。相比之下，核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）可將獲得結(jié)果的時間縮短到幾個小時。作為培養(yǎng)法的一種替代方法，必須證明NAT測試系統(tǒng)能夠檢測10 CFU/mL的支原體。為此，本研究中對三種不同的支原體PCR試劑盒進(jìn)行了測試，測試其在DMEM培養(yǎng)基中檢測不高于10 CFU/ml支原體的能力。

實驗設(shè)置和結(jié)果

在本次研究中，使用Microsart® AMP支原體試劑盒（包括樣品制備）和Microsart® AMP提取試劑盒（Sartorius Stedim Biotech GmbH）和其他兩種支原體檢測試劑盒進(jìn)行了驗證測試，這兩種檢測試劑盒也基于DNA分離和隨后的實時熒光定量PCR分析。使用10CFU靈敏度標(biāo)準(zhǔn)精氨酸支原體（NCTC編號10129）、口腔支原體（NCTC編號10112）和柑橘螺原體（NCTC編號10164）（Sartorius Stedim Biotech GmbH）作為測試材料。這些凍干標(biāo)準(zhǔn)品可以通過加入1 ml樣品基質(zhì)輕松再水化，達(dá)到10 CFU/ml的濃度。這些制劑旨在用于安全可靠地對支原體PCR分析進(jìn)行驗證。在這些比較研究中，使用含有5% FCS的DMEM培養(yǎng)基作為樣品基質(zhì)。

對于全部三種測定，根據(jù)制造商的手冊進(jìn)行DNA分離過程和隨后的PCR設(shè)定。Microsart® AMP提取試劑盒基于方便的二氧化硅柱方案，可在30分鐘內(nèi)完成。競爭產(chǎn)品的DNA分離基于磁珠法使DNA沉淀。在評估的三種PCR檢測方法中，兩種包括高度特異性的TaqMan探針；其中之一是Microsart® AMP支原體檢測試劑盒。第三種檢測方法的檢測混合物中含有SYBR Green，使得在DNA擴(kuò)增循環(huán)后需要進(jìn)行融解曲線分析，以區(qū)分非特異性擴(kuò)增DNA和支原體擴(kuò)增DNA。

每種樣品（精氨酸支原體、口腔支原體和柑橘螺原體）用每種試劑盒測試四次，包括DNA分離、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和數(shù)據(jù)分析的全過程。結(jié)果列于表1中。

表1：使用三家不同供應(yīng)商的試劑盒對DMEM培養(yǎng)基 + 5% FCS和10 CFU/ml 精氨酸支原體|口腔支原體|柑橘螺原體進(jìn)行PCR測試的結(jié)果

圖 1：使用Microsart® AMP支原體試劑盒的擴(kuò)增曲線，使用精氨酸支原體樣品（10 CFU/ml，在DMEM培養(yǎng)基 + 5% FCS中），PCR Cycler MxPro 3005P