細(xì)胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)

主要用途

YIJI細(xì)胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性抑制劑，通過(guò)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞樣品（動(dòng)物或人體）還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特異活性檢測(cè)。用于免疫、血液研究、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

NADPH氧化酶，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機(jī)體防御機(jī)制中的重要元素。NADPH氧化酶由6個(gè)亞體構(gòu)成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個(gè)phox（吞噬細(xì)胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含細(xì)胞膜嵌合蛋白質(zhì)分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶被激活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸�型輔酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O₂^-，由O₂^-又可生成H₂O₂和OH^－。其超氧陰離子產(chǎn)物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導(dǎo)致慢性肉芽腫�。–hronic Granulomatous Disease；CGD）�；�于底物還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在特異性抑制劑聯(lián)苯基三價(jià)碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），產(chǎn)生吸光峰值的變化，通過(guò)分光光度儀（340nm波長(zhǎng)）檢測(cè)，來(lái)測(cè)定NADPH氧化酶的特異活性。其反應(yīng)方式為：   

 產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

YIJI陰性液（Reagent E）   毫升

YIJI底物液（Reagent F） 微升

YIJI專性液（Reagent G）   微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）和YIJI陰性液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于光度測(cè)定的容器

分光光度儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YIJI 30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

• 從-70℃取出待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫預(yù)熱

• 背景對(duì)照測(cè)定
  • 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
  • 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
  • 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
  • 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent E）
  • 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
  • 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：（340波長(zhǎng)讀數(shù)）0分鐘－（340讀數(shù)）5分鐘 
    • 樣品總活性測(cè)定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測(cè)樣品（注意：50至100微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)5、11和12）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：（340波長(zhǎng)讀數(shù)）0分鐘－（340讀數(shù)）5分鐘
  • 樣品非特異活性測(cè)定
    • 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
    • 加入xx微升YIJI專性液（Reagent G）
    • 加入100微升待測(cè)樣品（注意：50至100微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)5、11和12）
    • 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置5分鐘
    • 放進(jìn)冰槽里備用
    • 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
    • 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
    • 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
    • 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
    • 加入上述冰槽里的xx微升含有YIJI專性液（Reagent G）和待測(cè)樣品的溶液  
    • 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
    • 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：（340波長(zhǎng)讀數(shù)）0分鐘－（340讀數(shù)）5分鐘
• 計(jì)算樣品活性

1）樣品總活性和非特異活性

2）樣品特異活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為21次（10個(gè)樣本）操作，包括1次背景對(duì)照測(cè)定
• 操作時(shí)，須戴手套
• YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F）注意避光
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品檢測(cè)前，須溶解和澄清 
• 加樣后3秒內(nèi)進(jìn)行光度測(cè)定
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對(duì)照0秒讀數(shù)一致
• 反應(yīng)測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定持續(xù)5分鐘
• 測(cè)定值由高到低變化，表明有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50至100微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低，則可以增加樣本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果使用純化目標(biāo)蛋白，則蛋白濃度為1至5微克/100微升；如果使用純化膜蛋白，則蛋白濃度為10微克/100微升
• 樣品實(shí)際活性是指聯(lián)苯基三價(jià)碘（diphenyleneiodonium；DPI）敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干擾因素
• NADPH氧化酶活性單位濃度定義：在30℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的還原型輔酶Ⅱ（NADPH）
• 本公司提供系列氧化酶類分析技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確