嗜肺軍團(tuán)菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?zé)晒夥ǎ?/p>

◆ 產(chǎn)品說明

致病菌檢測(cè)系列基于獨(dú)特的恒溫?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)，可針對(duì)食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化，自動(dòng)判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)。檢出限為10³ CFU/ml。 

◆ 產(chǎn)品組成（48測(cè)試）

012011M
試劑	含量
A-LS-I	1200μL × 1支
B-I	55μL × 1支
C-I	1200μL × 1支
D-I	1200μL × 4支
NG-I	50μL × 2支
PG-LS-I	50μL × 1支

◆ 適用儀器

    Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c等恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。

   2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。

 3）第三區(qū)：模板添加區(qū)。

   4）第四區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

7. 檢出限為10³ CFU/ml是以1 ml 10³ CFU/ml增菌液離心后收集菌體再提取的細(xì)菌基因組DNA作為模板。

◆ 樣品處理

參照《WS 394-2012 公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》中附錄B，采集集中空調(diào)系統(tǒng)冷卻水、冷凝水及其

形成的沉積物、軟泥等樣品中的水樣并測(cè)定嗜肺軍團(tuán)菌。其它洗浴水、溫泉水、景觀水等樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌測(cè)定可參照?qǐng)?zhí)行。

取滅菌的500 ml鐵質(zhì)布氏漏斗及配套的0.22 μm無菌濾紙，安裝于真空抽濾裝置上；取采集的水樣，顛倒混勻，

將200 ml水樣倒入漏斗；打開真空泵進(jìn)行抽濾，富集菌體于0.22 μm濾紙上；取出過濾后的濾紙轉(zhuǎn)移到滅菌塑料離心管內(nèi)，加入2 ml 無菌水，用移液器反復(fù)沖洗并置于振蕩器上充分振蕩，使過濾物溶于無菌水。

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

將試劑完全解凍，各組分離心30s。

1. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）：

若有N個(gè)待檢樣品，則參照下表，按照N+2個(gè)數(shù)量計(jì)算各組分用量（N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對(duì)照+1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照），將反應(yīng)液置于0.6ml或者1.5ml離心管中，渦旋混勻，離心30秒，分裝于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（約20μl）。

試劑	使用量
A-LS-I	22×(N+2)μL
B-I	1×(N+2)μL
反應(yīng)液總體積	23×(N+2)μL

1. 模板制備（樣本制備區(qū)）

1）將菌懸液搖勻稍靜止，取菌懸液1 mL，10000 rpm 離心3 min，盡量棄凈上清液；

    2）渦旋混勻DNA提取液，向沉淀中加入100 μL D-I，渦旋混勻，100℃加熱5 min；

3）10000 rpm離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用（2 μL上清用于核酸擴(kuò)增）。

3．添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

       在步驟1中已含有反應(yīng)液的PCR管中加入2μL模板，順序?yàn)镹G-I、待測(cè)樣品模板、PG-LS-I。渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

4. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

①恒溫儀器63℃條件下反應(yīng)30min。

      ②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個(gè)循環(huán)，于63℃ 45 s處收集熒光信號(hào)，30個(gè)循環(huán)。 

   其他儀器請(qǐng)參照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置。

◆ 結(jié)果判定

①儀器自動(dòng)判定結(jié)果，若顯示“陽(yáng)性”，則樣品中含有嗜肺軍團(tuán)菌；若顯示“陰性”，則樣品中不含有嗜肺軍團(tuán)菌或含量低于檢測(cè)限。

②在熒光定量PCR儀上，根據(jù)有無“S”型擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。若有“S”型擴(kuò)增曲線，則樣品中含有嗜肺軍團(tuán)菌；若無“S”型擴(kuò)增曲線，則樣品中不含有嗜肺軍團(tuán)菌或含量低于檢測(cè)限。 

• NG反應(yīng)管結(jié)果顯示“陰性”，PG反應(yīng)管結(jié)果顯示“陽(yáng)性”，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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