動(dòng)物細(xì)胞活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑盒產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)

主要用途

YIJI動(dòng)物細(xì)胞活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑是一種旨在通過(guò)機(jī)械或化學(xué)處理和差速離心方法，從動(dòng)物細(xì)胞中分離出完整的活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器組分的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種細(xì)胞（人體、動(dòng)物、昆蟲(chóng)等）的活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，可以被用于細(xì)胞色素P450系統(tǒng)外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白和腔內(nèi)蛋白等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。

技術(shù)背景

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細(xì)胞器組分，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)蛋白轉(zhuǎn)譯、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)成為細(xì)胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負(fù)責(zé)鈣離子區(qū)隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產(chǎn)和儲(chǔ)存等功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分成三種：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據(jù)細(xì)胞代謝的需要，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)互相轉(zhuǎn)換。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)核糖體合成蛋白質(zhì)并分類；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質(zhì)網(wǎng)的主要功能為儲(chǔ)存和釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：第一，通過(guò)機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，通過(guò)低速差速離心去除殘?jiān)�碎屑和巨大�?xì)胞器；第三，通過(guò)高速差速離心獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；甚至，第四，可以通過(guò)等密度離心獲得純度更高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI凈化液（Reagent C）   毫升

YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）   毫升

YIJI分離液（Reagent E）   毫升

YIJI保存液（Reagent F）   毫升

YIJI活性液（Reagent G）   微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

50毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

平式搖蕩儀：用于混勻

實(shí)驗(yàn)步驟

• 組織勻漿法

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent G）凍融，然后移出xx微升YIJI活性液（Reagent G）、xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心15分鐘，速度為12000g
• 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分
• 如果到此終止，即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• 或如果繼續(xù)分離，按照下列選擇步驟操作
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E），混勻顆粒群
• （選擇步驟）轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）再加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E）
• （選擇步驟）置于冰槽里
• （選擇步驟）放在平式搖蕩儀上混勻15分鐘，速度為100RPM
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為8000g
• （選擇步驟）移取上清液到2個(gè)預(yù)冷的6毫升超速離心管，保留離心后沉淀顆粒――此步驟獲得粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（沉淀顆粒）
• （選擇步驟）加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）放進(jìn)超速離心管到4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分
• （選擇步驟）分別加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻合并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）全部放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 化學(xué)處理法

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent G）凍融，然后移出xx微升YIJI活性液（Reagent G）、xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形離心管
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的xx微升YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為12000g
• 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分
• 如果到此終止，即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• 或如果繼續(xù)分離，按照下列選擇步驟操作
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E），混勻顆粒群
• （選擇步驟）轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）再加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E）
• （選擇步驟）置于冰槽里
• （選擇步驟）放在平式搖蕩儀上混勻15分鐘，速度為100RPM
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為8000g
• （選擇步驟）移取上清液到2個(gè)預(yù)冷的6毫升超速離心管，保留離心后沉淀顆粒――此步驟獲得粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（沉淀顆粒）
• （選擇步驟）加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）放進(jìn)超速離心管到4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分
• （選擇步驟）分別加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻合并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）全部放進(jìn)－70℃冰箱里保存

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為10次（5 X 10⁷細(xì)胞/次）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent F）
• 所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常5 X 10⁷細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量為500至1000微克蛋白

11． 本產(chǎn)品所獲得的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純度和產(chǎn)量最為理想

12． 如果需要獲得95％以上純度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使用YIJI動(dòng)物細(xì)胞高質(zhì)純化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑盒

13． 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志蛋白是NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用YIJI 組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

• 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶