驢源性成分核酸檢測(cè)試劑盒（一管式PCR-熒光探針?lè)ǎ┦褂谜f(shuō)明書(shū)

◆ 產(chǎn)品說(shuō)明

物種鑒定系列可針對(duì)食品、飼料等樣品中動(dòng)物源性成分的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于驢源性成分的檢測(cè)，檢出限為0.1%。

◆ 產(chǎn)品組成（96測(cè)試）

021122LⅡ
試劑	含量
A-驢源-P	20μL × 8管× 12排
NG-P	100μL × 3支
PG-驢源-P	100μL × 2支

 

• 適用儀器

    ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

 ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機(jī)；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開(kāi)蓋易造成氣溶膠污染，禁止開(kāi)蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆樣品處理

參照《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光PCR法》或其他標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，制備的樣本保存待用。

樣品的采集和制備是動(dòng)物源性鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性消耗品，研缽應(yīng)經(jīng)160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應(yīng)使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。

取樣應(yīng)盡量采取肌肉組織，對(duì)于同一批樣品，應(yīng)多點(diǎn)采集合并后，作為一份樣品進(jìn)行均質(zhì)，提取DNA。

采樣過(guò)程應(yīng)快速完成，將采取的樣品迅速放入組織攪碎機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)成糜狀，充分混勻，取0.1 g充分混勻的樣品，采用液氮研磨或均質(zhì)器均質(zhì)。

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

1.模板制備（樣本制備區(qū)）

  建議使用配套動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒，具體過(guò)程詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進(jìn)行）

  剪下所需測(cè)試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開(kāi)封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G、待測(cè)樣品模板、PG-驢源-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3.擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

   按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

 

PCR循環(huán)			熒光收集位點(diǎn)
95℃	10分鐘	1個(gè)循環(huán)	—
95℃	15秒	40個(gè)循環(huán)	—
60℃	1分鐘		※

4.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值線應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)

◆結(jié)果判定

檢測(cè)樣品無(wú)Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有驢源性成分或含量低于檢出限；

檢測(cè)樣品Ct≤35，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性，含有驢源性成分；

檢測(cè)樣品Ct＞35，可直接報(bào)告樣品陰性，不含有驢源性成分或含量低于檢測(cè)限。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無(wú)效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無(wú)效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。