一．關(guān)于自噬及LC3

1. 自噬

大自噬（macroautophagy），也就是通常說的自噬（autophagy），是真核細(xì)胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的成分（細(xì)胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進(jìn)而傳遞到溶酶體進(jìn)行降解的過程。詳細(xì)來(lái)說，自噬過程與內(nèi)涵體途徑（endolysosomal pathway）密不可分（見圖1）。一方面，自噬體能夠與晚期內(nèi)體（late endosome）融合形成中間囊泡（amphisome）最終形成自噬溶酶體（autolysosome）；另一方面，自噬體能夠直接與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體。無(wú)論通過哪條途徑，自噬溶酶體最終通過酸性水解酶將細(xì)胞器、蛋白等消化分解。

細(xì)胞本底水平的自噬發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，可保護(hù)細(xì)胞免受錯(cuò)誤折疊蛋白或受損細(xì)胞器的影響，從而防止某些疾病的發(fā)生（如神經(jīng)退行性疾病和癌癥）。饑餓等也可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，通過降解大分子物質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量。

 

圖1 自噬過程及其與內(nèi)涵體途徑的關(guān)系

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

 

2. LC3 

LC3（light chain 3）簡(jiǎn)稱于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。哺乳動(dòng)物中的LC3與酵母中的自噬相關(guān)蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸殘基，產(chǎn)生細(xì)胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）共價(jià)結(jié)合，形成LC3-II并定位于自噬體膜上（見圖2）。哺乳動(dòng)物中的LC3可分為三種： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作為L(zhǎng)C3的一種，同樣可以用作自噬的分子標(biāo)志。

 

圖2  LC3在自噬體形成中的作用

(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)

 

二．自噬流檢測(cè)方法

細(xì)胞經(jīng)自噬誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬流的水平進(jìn)行觀察和檢測(cè)，常用的技術(shù)手段見表1：

 

 

表1 自噬體計(jì)數(shù)及自噬流檢測(cè)方法匯總

（Mizushima et al, Cell, 2010）

其中，電鏡觀察法由于受到實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備的限制應(yīng)用范圍有限；而由于自噬過程發(fā)生快速，通過IB/WB檢測(cè)LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)的影響。

想要準(zhǔn)確檢測(cè)自噬流的變化，需要多種技術(shù)手段共同使用，才能達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果，產(chǎn)生具有說服性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

三．維真自噬雙標(biāo)病毒產(chǎn)品

mCherry-GFP-LC3B腺病毒

mCherry-GFP-LC3B慢病毒

mCherry-GFP-LC3B腺相關(guān)病毒

   

四．維真自噬雙標(biāo)系統(tǒng)的工作原理

   未發(fā)生自噬的細(xì)胞及含有自噬體的細(xì)胞中，由于mCherry與GFP共同表達(dá)，細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光。當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環(huán)境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進(jìn)而使自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進(jìn)程受阻（見圖3）。

圖3 mCherry-GFP-LC3B雙標(biāo)系統(tǒng)工作原理

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

 

圖4 維真自噬雙標(biāo)病毒載體圖譜

五．維真 mCherry-GFP-LC3B 自噬雙標(biāo)操作方法

（一）體外實(shí)驗(yàn)

以2型AAV病毒為例，維真為您推薦的MOI值10⁴-10⁵，是根HEK293細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)，不同的細(xì)胞所使用的病毒MOI值會(huì)有所不同。建議您感染目的細(xì)胞前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對(duì)照病毒來(lái)摸索條件。

1. 為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2. 將目的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞融合率為50%為最佳。為保證細(xì)胞生長(zhǎng)良好，請(qǐng)保證細(xì)胞貼壁過夜。

3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養(yǎng)基中做1:10稀釋（10^-1），以此為起點(diǎn)做梯度稀釋直至稀釋10^-7�？筛鶕�(jù)實(shí)際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

4. 取出提前準(zhǔn)備好的96孔板，先確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀況是否良好。用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)基，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對(duì)照組。

5. 在加入病毒稀釋液后，請(qǐng)?jiān)?2-24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)來(lái)確認(rèn)加入的病毒量是否合適，是否因?yàn)榧尤氲牟《玖坑绊懠?xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞沒有變化，即所加病毒對(duì)細(xì)胞沒有毒性，可以繼續(xù)培養(yǎng)。

6. AAV病毒對(duì)細(xì)胞的感染較慢，請(qǐng)?jiān)诟腥炯?xì)胞后每天觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況。

另：如果您選擇的產(chǎn)品沒有熒光標(biāo)簽請(qǐng)?jiān)?6小時(shí)以后的不同時(shí)間段分別收獲細(xì)胞并通過Western-Blot或其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)。

注：由于AAV組織特異性，體外感染細(xì)胞的效率比較低，所以我們強(qiáng)烈推薦您購(gòu)買AAV用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

（二）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

針對(duì)小鼠/大鼠來(lái)說，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，詳情可查閱維真官網(wǎng)。

六．常見問題解答

1.重組AAV 安全嗎?

迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無(wú)需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。

2.哪些血清型的 AAV 可供選擇？我該選用哪種AAV呢?

目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 &  AAV9。請(qǐng)參閱下面指南中參考文獻(xiàn)的建議。

3.使用重組腺相關(guān)病毒rAAV傳遞基因的優(yōu)勢(shì)是什么?請(qǐng)同時(shí)參閱轉(zhuǎn)染效率與不同細(xì)胞類型對(duì)照表，以確定哪種血清型AAV更適合您的細(xì)胞。

rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂細(xì)胞、免疫原性極小、體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)。

4.AAV 載體穩(wěn)定嗎? 如何保存AAV載體?  

純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩(wěn)定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長(zhǎng)期保存。

5.訂制AAV服務(wù)，客戶需要提供哪些材料? &客戶收到的產(chǎn)品是怎樣的?

您可以從我們的人源全長(zhǎng)cDNA庫(kù)(17,000預(yù)制ORF)中挑選，或者提供您的質(zhì)粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標(biāo)簽和AAV血清型。

基因沉默服務(wù)，請(qǐng)您提供確切的shRNA的序列以構(gòu)建重組rAAV載體。我們的標(biāo)準(zhǔn)載體具有U6啟動(dòng)子和GFP標(biāo)記。

通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根據(jù)客戶的需要，提供特定體積和滴度的產(chǎn)品。

附：維真自噬雙標(biāo)系統(tǒng)感染誘導(dǎo)自噬的HEK293細(xì)胞效果圖