• 產(chǎn)品說明

病菌檢測系列可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測。檢出限為10³ CFU/ml。

•  產(chǎn)品組成（96測試）

◆ 所需儀器

ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR擴增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設(shè)備。（使用熒光定量PCR儀進行定性判讀時則無需電泳設(shè)備）

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。

◆ 樣品處理

參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》中的操作步驟進行前增菌。建議使用試劑配套細菌基因組DNA提取系列產(chǎn)品。

◆ 實驗操作

1．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進行）

取所待檢樣品數(shù)+3的12聯(lián)反應(yīng)管，將試劑完全解凍，分離心30s。離心后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應(yīng)液中分別加入2μL模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應(yīng)管中）。

加樣示例：（有2個待測樣品）

取5排12聯(lián)反應(yīng)管，按順序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加樣品1，第四排全部加樣品2，第五排全部加PG-Ecoli。

蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

2. 擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   按下列條件設(shè)置擴增反應(yīng)：（如需使用熒光法進行檢測請選擇FAM通道）

3. 產(chǎn)物電泳（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

稱量4. 0g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右時，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為0.5μg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于10cm，厚度宜為3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當瓊脂糖凝膠完全凝結(jié)硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰極端。向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1mm~2mm。將 5μL PCR產(chǎn)物與1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽性對照的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據(jù)公式：電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5V/cm計算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動電壓開關(guān)，電泳開始以正負極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準。電泳30min~45min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。

• 可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸熒光染料替代EB。
• 推薦使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp條帶的Marker。

• 結(jié)果分析

• 陰陽性判讀：

進行電泳檢測時，需對比Marker進行判斷，當目的靶標對應(yīng)位置出現(xiàn)單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性；否則為該靶標檢測為陰性。（使用熒光定量PCR儀檢測時，檢測孔Ct≤30時判斷該孔為陽性；當檢測孔Ct＞30時，該檢測孔為陰性）

示例電泳圖

• 有效性判讀：

需同時滿足：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中uidA泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性，此時可判斷實驗有效。如無法滿足上述條件，則實驗無效，需重復(fù)實驗；如重復(fù)后結(jié)果仍為無效，請于本公司技術(shù)支持聯(lián)系。

• 結(jié)果判讀：

在實驗有效的情況下，可根據(jù)下表進行判讀：

• 97%以上大腸埃希氏菌為uidA陽性，可參考陰性對照中該基因檢測結(jié)果判斷擴增效果；
• 當結(jié)果判定為EPEC陽性時，若bfpB靶標為陽性則說明樣品含有典型EPEC；若bfpB靶標為陰性則說明樣品為非典型EPEC；
• 當結(jié)果判定為STEC/EHEC陽性時，若eae靶標為陽性則說明樣品含有典型EHEC；若eae靶標為陰性則說明樣品為非典型EHEC。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

   2）第二區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產(chǎn)生的所有廢棄物及時處理。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒。

5．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。