P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑是一種旨在通過供體大腸桿菌制備具有部分細(xì)菌基因的噬菌體，感染特定受體大腸桿菌，獲得細(xì)菌之間基因片段的轉(zhuǎn)移，而獲得遺傳重組的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于通用型非特異性基因片段的轉(zhuǎn)導(dǎo)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。

技術(shù)背景

噬菌體（bacteriophage或phage）是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物，并使其細(xì)胞裂解死亡的病毒，本世紀(jì)初在葡萄球菌和志賀菌中首先發(fā)現(xiàn)。噬菌體具有病毒的一些特性：個(gè)體微小，可以通過濾菌器；沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成的衣殼和包含于其中的核酸組成；只能在活的微生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物。在含細(xì)菌的固體培養(yǎng)基上，噬菌體使細(xì)菌細(xì)胞裂解而形成的空斑，稱為噬菌斑。每個(gè)空斑都是由一個(gè)噬菌體顆粒一再侵染、增殖、裂解所形成的，故可用于進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)。由于噬菌體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因數(shù)少，容易獲得大量的突變體，因此是研究核酸以及核酸與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。P1噬菌體是一種針對(duì)大腸桿菌的通用型轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，既可以包裝（packaging），又能轉(zhuǎn)導(dǎo)，成為微生物基因組非特異性基因片段（長(zhǎng)達(dá)100kb）操作的標(biāo)準(zhǔn)化模型工具。 

產(chǎn)品內(nèi)容

專養(yǎng)液（Reagent A） 毫升

溶解液（Reagent B）      毫升

普養(yǎng)液（Reagent C） 毫升

轉(zhuǎn)導(dǎo)液（Reagent D） 毫升

強(qiáng)化液（Reagent E） 毫升

產(chǎn)品說明書         1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

P1噬菌體：用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體

供體/受體宿主細(xì)菌：用于噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的目標(biāo)

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

9cm直徑細(xì)菌培養(yǎng)皿：用于受體細(xì)菌選擇培養(yǎng)的容器

培養(yǎng)箱：用于細(xì)菌培養(yǎng)

恒溫?fù)u床：用于宿主細(xì)菌培養(yǎng)

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

實(shí)驗(yàn)步驟

一、P1噬菌體制備

• 移取xx毫升專養(yǎng)液（Reagent A）到15毫升錐形離心管
• 加入50微升用戶自備的過夜新鮮培養(yǎng)的供體宿主細(xì)菌（10⁸ 細(xì)菌/毫升）
• 放進(jìn)37℃恒溫?fù)u床孵育45分鐘，速度為220RPM
• 加入100微升用戶自備的P1噬菌體（5 X 10⁹ PFU/毫升），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫?fù)u床孵育3小時(shí)或直至細(xì)菌完全溶解，速度為220RPM（注意：光線下未見漂浮的顆粒碎片）
• 加入xx微升溶解液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫?fù)u床孵育5分鐘，速度為220RPM
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為9200g
• 移取4毫升上清液到新的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)

• 移取xx毫升普養(yǎng)液（Reagent C）到15毫升錐形離心管
• 加入5微升用戶自備的受體宿主細(xì)菌（10⁸ 細(xì)菌/毫升）
• 放進(jìn)37℃恒溫?fù)u床孵育過夜，速度為220RPM
• 移取1.5毫升菌液到新的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g
• 小心去掉上清液
• 加入xx微升轉(zhuǎn)導(dǎo)液（Reagent D），混勻顆粒群
• 準(zhǔn)備好4個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至4號(hào)管
• 分別加入100微升上述制備的受體宿主細(xì)菌到每個(gè)離心管
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到1號(hào)管，混勻
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到2號(hào)管，混勻
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到3號(hào)管，混勻

• 室溫下孵育30分鐘
• 分別加入xx毫升強(qiáng)化液（Reagent E），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫?fù)u床孵育1小時(shí)，速度為220RPM
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g
• 小心去掉上清液
• 加入xx微升普養(yǎng)液（Reagent C），混勻顆粒群
• 鋪板在用戶自備的90mm直徑的瓊脂糖選擇細(xì)菌培養(yǎng)基上（注意：含有抗生素等選擇培養(yǎng)基）
• 倒置細(xì)菌培養(yǎng)皿
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育16小時(shí)
• 觀察和計(jì)數(shù)——對(duì)照組無菌落生長(zhǎng)；P1噬菌體量越多，轉(zhuǎn)導(dǎo)體細(xì)菌菌落越多
• 挑選1個(gè)獨(dú)立的菌落
• 在用戶自備的90mm直徑的瓊脂糖選擇細(xì)菌培養(yǎng)基上劃線分離
• 倒置細(xì)菌培養(yǎng)皿
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育16小時(shí)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟23至26一次
• 后續(xù)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)體菌落：PCR擴(kuò)增或測(cè)序

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 整個(gè)操作須無菌操作
• 使用時(shí)，切莫污染母液
• 通常使用P1virW3110噬菌體為佳
• 通常的宿主細(xì)菌含有遺傳標(biāo)記，便于篩選
• 本產(chǎn)品可以獲得100至1000轉(zhuǎn)導(dǎo)體菌落/毫升PI噬菌體
• 如果需要徹底去除殘余菌體，獲得不含宿主細(xì)菌的噬菌體原液，可以使用0.45微米孔徑的過濾器過濾
• P1噬菌體制備后的效價(jià)鑒定，建議使用 P1噬菌體效價(jià)檢測(cè)試劑盒——60091
• 選擇培養(yǎng)基的抗生素參考劑量如下

• 本公司提供系列噬菌體實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無細(xì)菌污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定繁殖效價(jià)高