動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及外源基因?qū)�入的原理和操作步驟

實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點(diǎn)，一是研究對(duì)象是活的細(xì)胞，可長時(shí)期地監(jiān)控、檢測甚至定量評(píng)估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)等；二是可以人為地嚴(yán)格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生物等外界因素對(duì)細(xì)胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達(dá)到比較均一性。常用的細(xì)胞系均是性質(zhì)均一的細(xì)胞，需要時(shí)還可采用克隆化等方法使細(xì)胞進(jìn)一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細(xì)胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實(shí)驗(yàn)的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費(fèi)用相對(duì)經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。
然而，細(xì)胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細(xì)胞脫離了機(jī)體復(fù)雜的環(huán)境條件，其細(xì)胞形態(tài)和功能都會(huì)發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)的細(xì)胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細(xì)胞視為一種既保持動(dòng)物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體。
由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是其他實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對(duì)于分子生物學(xué)家及細(xì)胞生物學(xué)家而言，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)感興趣的基因產(chǎn)物進(jìn)行定位、運(yùn)動(dòng)及功能研究變得越來越重要。在克隆一個(gè)基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細(xì)胞，以分析其表達(dá)，測定表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_(dá)的基因產(chǎn)物純化。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞有兩種途徑：穩(wěn)定（永久）或暫時(shí)性轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的是將轉(zhuǎn)移基因整合到細(xì)胞染色體DNA上，形成穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞系。一般需要共轉(zhuǎn)染一個(gè)選擇標(biāo)記，用于追蹤轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染效率。暫時(shí)性轉(zhuǎn)染的目的是為了分析轉(zhuǎn)移基因的暫時(shí)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，一般在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)進(jìn)行。針對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的外源DNA導(dǎo)入已發(fā)展出多種技術(shù)，其中常用的有磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法等。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暫時(shí)性轉(zhuǎn)染和永久性轉(zhuǎn)染。但它們有各自適用的細(xì)胞系。培養(yǎng)的細(xì)胞不同，其在攝取和表達(dá)外源DNA的能力上可能存在幾個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。因此針對(duì)細(xì)胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要。 
Graham和Vander EB（1973）首次報(bào)告了用Ca₃(PO₄)₂-DNA沉淀將腺病毒SV40導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，Wigler等（1978）證明這種方法也能用于導(dǎo)入并在哺乳動(dòng)物染色體上穩(wěn)定整合外源DNA。至今對(duì)于磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染的確切機(jī)理仍不清楚。一般認(rèn)為轉(zhuǎn)移DNA通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)入細(xì)胞核，而CaPO₄處理被認(rèn)為是產(chǎn)生了一種能促使DNA附著在細(xì)胞表面的環(huán)境。 
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，對(duì)于機(jī)體的組織發(fā)育、器官分化及多種病理過程均具有重要作用。細(xì)胞凋亡具有典型的形態(tài)學(xué)及生化特征。包括細(xì)胞膜皺縮，胞間連接減少，染色體凝集，細(xì)胞核崩解并形成凋亡小體等。其中一個(gè)強(qiáng)有力的生化指標(biāo)是“DNA Ladder”的產(chǎn)生，由于凋亡相關(guān)的特異核酸酶在凋亡過程中的激活，凋亡細(xì)胞的總DNA可以在核小體間進(jìn)行切割，提取總DNA進(jìn)行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶（DNA Ladder）。一般認(rèn)為出現(xiàn)DNA Ladder 的細(xì)胞肯定發(fā)生了凋亡，但并非所有發(fā)生凋亡的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)DNA Ladder。這種檢測方法也受到靈敏性的限制，只有當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞占到細(xì)胞總量的15%以上時(shí)，特異降解的DNA經(jīng)過電泳才會(huì)較好地顯示DNA Ladder。 
細(xì)胞凋亡的信號(hào)可能來自于細(xì)胞外部或細(xì)胞內(nèi)部。其中死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑（Death-receptor Pathway）是細(xì)胞外部信號(hào)（細(xì)胞因子）誘導(dǎo)凋亡的主要方式。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體家族，其共同特征是具有一個(gè)同源的死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD,）。當(dāng)死亡受體的配體與之結(jié)合以后或死亡受體本身過量表達(dá)均可促使受體的死亡結(jié)構(gòu)域的寡集化，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC, death-inducing signaling complex），DISC通過其它一些接頭蛋白（adaptor protein），活化凋亡特異性蛋白酶Caspase-8，從而啟動(dòng)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生包括“DNA Ladder”在內(nèi)的一系列生理特征。死亡受體中較為典型的是CD95（Fas）和TNF-R1。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)?93細(xì)胞中過量表達(dá)TNF-R1，誘導(dǎo)293細(xì)胞凋亡，觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)并檢測其“DNA Ladder”。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 細(xì)胞營養(yǎng)液（DMEM液體培養(yǎng)基，10％胎牛血清，雙抗100單位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO₄·2H₂O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ過濾除菌），CaCl₂（2.5M，0.2μ過濾除菌）溶液，超純水（滅菌）。
3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，無水乙醇，酚/氯仿，DNA上樣緩沖液，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，EB。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿

2. 50ml、15ml一次性離心管

3. 10ml玻璃吸管（滅菌），與玻璃吸管配套的吸球及膠管

4. 二氧化碳培養(yǎng)箱

5. 倒置顯微鏡
6. 20μl，200μl微量移液器

7. 1.5ml離心管（滅菌）

8. 200μl微量移液器頭

9. 1ml微量移液器

10. 低速臺(tái)式離心機(jī)

11. 高速臺(tái)式離心機(jī)

12. 4°C，－20°C冰箱

13. DNA凝膠電泳設(shè)備

14. 紫外凝膠成像儀

實(shí)驗(yàn)材料

胚腎細(xì)胞系293，TNF－R1哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒（CsCl超速離心純），哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體（CsCl超速離心純）。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 293細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（第一天） 
   1) 顯微鏡觀察母細(xì)胞的生長狀態(tài)，確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，必需保證細(xì)胞處于合適的生長密度，因此應(yīng)根據(jù)母細(xì)胞的生長密度調(diào)整傳代比例。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的合適細(xì)胞密度為50％－70%，本實(shí)驗(yàn)中使用的293細(xì)胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。 
   2) 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋，倒去皿中的細(xì)胞營養(yǎng)液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動(dòng)，將溶液倒出。 
   3) 消化與分裝。 
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細(xì)胞變圓且彼此分離表明消化完全，此時(shí)可加入10ml營養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，使培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細(xì)胞懸液。按照傳代的比例補(bǔ)加適當(dāng)體積的營養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。 
在分裝好的細(xì)胞培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 
2. 用磷酸鈣介導(dǎo)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293細(xì)胞中過量表達(dá)TNF－R1（第二天） 
   1) 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長狀態(tài) 
      a. 觀察細(xì)胞是否污染 
      b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化 
      c. 觀察細(xì)胞的生長密度 
   2) 轉(zhuǎn)染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質(zhì)粒DNA（實(shí)驗(yàn)組為TNF-R1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，對(duì)照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動(dòng)使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。 
3. 凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 
   1) 顯微鏡觀察過量表達(dá)TNF-R1（實(shí)驗(yàn)組）和空載體（對(duì)照組）的293細(xì)胞形態(tài)上的差異。 
   2) 用10ml玻璃吸管將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重懸細(xì)胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C靜置20分鐘。 
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。