1.投量一般是按摩爾數(shù)比來(lái)算的，大概是需要接入氨基的個(gè)數(shù)的2倍投量。用這個(gè)方法換算的話，因?yàn)椴恢��?nbsp;IRB-NHS 里面含有幾個(gè)活性酯，所以具體的量無(wú)法確定。
答復(fù)：每個(gè)IRB-NHS中只有一個(gè)活性酯，但由于IRB-NHS本身水解作用，其投料比往往控制在伯氨基的1.5-2.0倍左右。

2.標(biāo)記抗體時(shí)，抗體與染料的投料比是多少？
答復(fù)：是1:3（摩爾比），大概每個(gè)抗體上可以標(biāo)記1個(gè)左右熒光基團(tuán)。

3.想用這個(gè)染料修飾的材料的分子結(jié)構(gòu)式中含有氨基（伯胺）和羧基，有兩個(gè)問(wèn)題：
1)羧基會(huì)不會(huì)參與反應(yīng)？如果會(huì)的話我需要如何處理？
答復(fù)：羧基不會(huì)參加反應(yīng)，IRB-NHS只與待標(biāo)記材料中的伯氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵。
2)這種染料在與伯胺反應(yīng)后，水溶性如何，還會(huì)有何種水溶性基團(tuán)。
答復(fù)：熒光基團(tuán)本身含兩個(gè)磺酸基，其水溶性很好，不會(huì)現(xiàn)在改變所標(biāo)記材料的水溶性。

4.該染料的分子結(jié)構(gòu)信息，可否提供？
答復(fù)：母核是花菁類染料，可以提供其基本結(jié)構(gòu)。

5.關(guān)于“配制的DMF稀釋液需立即使用。存放導(dǎo)致活性迅速喪失”這個(gè)說(shuō)明，染料標(biāo)記上靶分子以后，熒光可以持續(xù)多久？
答復(fù)：活性喪失主要是指活性NHS酯基基團(tuán)破壞，無(wú)法與待標(biāo)記材料商氨基鍵合，并非指熒光信號(hào)本身消失。連接上目標(biāo)材料后，低溫避光保存，固體狀態(tài)熒光可以維持?jǐn)?shù)月，液體狀態(tài)數(shù)周。

6.有一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案如下：標(biāo)記的是一個(gè)多肽，共61個(gè)氨基酸，大小為6.6KD。
1)多肽溶于無(wú)菌PBS中，終濃度為10 mg/ml。
2)將0.2mg IRB-NHS 粉末配置成  DMSO 溶液( 0.01 mg/uL)。
3)將配置好的20ul染料立即逐滴分別滴加至200ul 10mg/ml 多肽溶液中，至于搖床，室溫反應(yīng)2 h。
4)反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液加入超濾管中進(jìn)行超濾（ 4000 rpm，30×3min ）取超濾管上層溶液。
5)尾靜脈注射SCID小鼠，100ul IRB-NHS -V5/mice
   請(qǐng)問(wèn)這個(gè)方案合理嗎？

答復(fù)：該方案基本合理。反應(yīng)環(huán)境pH可以控制在7.4-8.3之間。IRB-NHS使用量（摩爾數(shù)）應(yīng)為根據(jù)每條多肽期望的熒光基團(tuán)個(gè)數(shù)的兩倍量。另要確保多肽上有足夠的伯胺基可以與NHS活性酯反應(yīng)。另外，盡量避免多肽上功能區(qū)域的胺基與熒光基團(tuán)反應(yīng)從而影響多肽活性。反應(yīng)結(jié)束后，建議純化后觀察材料顏色。成功標(biāo)記后的材料應(yīng)該呈深綠色。

7.抗腫瘤抗體，190KD，想做近紅外靶向成像實(shí)驗(yàn)，抗體和染料的比例是多少？在尾靜脈100ul情況下打入的抗體應(yīng)該控制到多少摩爾，多少質(zhì)量會(huì)有比較好的成像效果？感覺(jué)最重要的環(huán)節(jié)就是比例和用量，不然小分子多的話靶向性真的體現(xiàn)不好，其他代謝部位都有擴(kuò)散。  
答復(fù)：一般每個(gè)抗體上標(biāo)記2-5個(gè)近紅外熒光分子就能夠很好進(jìn)行成像�？贵w注射劑量與診斷和治療目標(biāo)有關(guān)，有很多文獻(xiàn)可以查到！標(biāo)記到抗體上的熒光基團(tuán)由于數(shù)量很少，不會(huì)對(duì)抗體靶向性產(chǎn)生影響！

8.激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響多大？有的儀器沒(méi)有789nm的波長(zhǎng)？
答復(fù)：最佳條件是在探針最大吸收處激發(fā)，但在730-780 nm處激發(fā)都有較強(qiáng)信號(hào)！ 

9.感覺(jué)這個(gè)固體粉末是不時(shí)間稍久就會(huì)沾到管壁上，上次做的時(shí)候，用的是實(shí)驗(yàn)室?guī)熜忠郧百I的，但都沾到了管壁上，不能夠?qū)嶋H稱量，我就用DMSO溶解了，但感覺(jué)比例就加的不對(duì)了，染料可能加多了，胃腸處的熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，都曝紅曝白了
答復(fù)：活體注射是要摸索劑量的。該探針由于含有NHS基團(tuán)，不宜長(zhǎng)期存放，建議購(gòu)買后3個(gè)月內(nèi)使用！不能配成溶液后存放!

10.在染料和抗體偶聯(lián)完后，三次超濾后仍見(jiàn)超濾下來(lái)的液體是綠色，是否為染料加入過(guò)多？是否要超濾到無(wú)色為止？
答復(fù)：最好超濾液中不要有明顯綠色！但也有可能是濾膜不好導(dǎo)致抗體濾出導(dǎo)致顏色。

11.如果多肽分子量太小，1.5KD 用什么純化方法比較好？可以用HPLC純化嗎？
答復(fù)：一般利用層析柱分析。根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離。探針?lè)肿恿繛?00，所以很容易進(jìn)行分離。

12.多肽是1400，不好分啊？cy5.5可以用HPLC不知道你們的這個(gè)可以不？HPLC對(duì)偶聯(lián)后的多肽和IR影響大嗎？
答復(fù)：1400和標(biāo)記熒光基團(tuán)后的2200還是可以用層析住分的。分子量還是差別較大的。也可以用HPLC分。不過(guò)更耗時(shí)一些。

13.1.4KD的多肽和IR783耦連后，如何把多余的IR783去除掉？具體一點(diǎn)的方法。
答復(fù)：利用標(biāo)記前后分子量不同可以通過(guò)柱層析分離。